Способ определения протеолитической активности молока Советский патент 1984 года по МПК C12N9/00 C12N9/50 

Изобретение относится к биохимии сельскохозяйственных животных, в частности к способам определения активности прртеолитических ферментов молозива и молока для оптимизации рационов в кормлении телят раннего онтогенеза. Участие ферментов молозива и молока в процессах пищеварения телят в первые часы и дни их жизни весьма актуально, так как их развитие и рост, зависят от качества этик продуктов, используемых в качестве основных пищевых субстратов. Известен способ определения активности сериновых протеиназ в тканевых гомогенатах, основанный на расщеплении специфического флюоресцентного субстрата карбоксибензоил-7-аминокумарина солянокислого с последующим учетом результато по степени образования 7-аминокумарина Cl . Однако этот способ не пригоден дл определения протеолитической активности молока. Известен способ определения проте литической активности молока, основан ный на расщеплении специфических субстратов - бензоил-лизии-парн-нитроанилида и бензоил-аргинин-пяра-нит роанилида, протеазами молока, по сте пени образования нитроанилина С2 3. Однако известный способ имеет низку чувствительность и не позволяет опреде лять активность фермента в молозиве. Унифицированного способа определе ния протеолитической активности в молозиве и в молоке в мировой, .практике нет. Цель изобретения - повьшение чувс вительности способа.определения активности фермента во фракциях молока. Поставленная цель достигается тем что согласно известному способу пере добавлением специфического субстрата из молока выделяют казеиновую фракци специфический субстрат вводят в обез жиренное молоко и в казеиновую фракцию, а определение протеолитической активности осуществляют в молоке и казеиновой фракции, при этом при определении протеолитической активност в молоке в качестве специфического субстрата используют карбоксибензоил аргинин-7-аминокумарин солянокислый, а в казеиновой фракции - иммобипизо12 ванный на сефарозе 4В казеин, меченый флюорескамином. Гидролиз проводят в присутствии буфера трис -нее 0,2М, рН 8,0-8,5 в течение 18-22 ч. Сущность предложенного способа состоит в следующем. Для определения протеолитической активности в образцах свежевыдоенное молоко и молозиво обезжиривают, центрифугируя 500-1000 об/мин 20-25 мин при 0-4°С. Дале.е готовят 0,4М раствор карбоксибензоил-аргинин-7-амин.окумарина в 0, -нсб буфере, который готовят в день определения. За.тем к 2,0-2,5 мл обезжиренного молока прибавляют 2,0-2,5 мл раствора карбоксибензаил-аргинин-7-аминокумарина. Гидролиз проводят в стерильных условиях или с использованием бактерицидных агентов (толуол, хлороформ, неомицин и др.). Параллельно ставят контрольную пробу, для этого в две пробирки отдельно берут по 2,0-2,5 мл молока и 2,0-2,5 мл раствора субстрата. Образцы и контрольную пробу инкубируют 18-22 ч при 37°С. Гидролиз останавливают цодкислением реакционной среды до рН 3,5-4,0 ледяной уксусной кислотой.Осадок, образующийся после денатурации белков молока, отделяют центрифугированием при 20003000 об/мин 10-15 мин или фильтрованием. В прозрачном супернатанте определяют флюоресценцию на флюориметре типа Хитачи, Активация и эмиссия растворов образцов 380 и 440 нм соответственно. При определении связанной с мицеллами казеина протеиназы в качестве субстрата используют иммобилизованный на сефарозе 4В казеин, меченый флюорескамином.; Для активирования сефарозы 4В 30,0-30,5 г сефарозы суспензируют в 30,0 - 30,5 мл 2М раствора NajCO и помещают в ледяную баню. К суспензии сефарозы добавляют раствореннох-о 5,0-4,5 г BI-CN в 3,0 - 3,3 мл ацетонитрила. Реакцию активирования проводят при 1 - 4°С и рН строго 11,0. Значение рН во время реакции поддерживают 8 н. NaOH. По окончании реакции CMecj помещают на стеклянный фильтр и быстро промывают i л охлажденной до +4 - -{-1р С дистиллированной воды, затем трехкратнь1м объемом холодного 6,2 М боратноуглекислонатриевого буфера (рН 10,0 - 10,5), Сразу же после активации добавляю раствор лиганда - 4,5 - 5,0%-ный рас вор казеина. Реакцию проводят в тече ние 16-20 ч при А°С при постоянном медленном помешивании, чтобы не повредить частицы геля. После пришивани лиганда казеин -сефарозу отмывают на стеклянном фильтре большим количеством дистиллированной воды, тремя объемами 2М трис-НСб буфера рН 8,08,1. Осадок казеин-сефарозы суспензируют в трех объемах 2М трис-НСЕ бу фера и оставляют при комнатной температуре 1,5 - 2 ч для блокирования открытых реакционных групп сефарозы После этого суспензию повторно промы вают на фильтре большим количеством дистиллированной воды и двумя объемами 0,1 М боратноуглекислонатриевог буфера рН 7,9 - 8,0. Казеин-сефарозу 4В суспензируют в равном объеме 0,2 Мтрис-НСС буфера рН 7,9 - 8,0 и сохраняют при +4°С. Препарат стабилен в. течение шести месяцев. Непосредственно перед анализом казеин-сефарозу 4В метят флюорескамином. Для этого к суспензии сефарозы добавляют 0,1 объем (V/V) 0,1 0,15%-ного раствора флюорескамина в ацетоне. Дпя удаления излишков флюорескамина суспензию промывшот на стеклянном фильтре 20 объемами 0,2 М трис -нее буфера рН 8,0-8,1. В таком виде препарат готов для использования в качестве субстрата. Для получения фракции казеина к образцу Свежевьздоенного обезжи ренного молозива или молока по каплям прибавляют 1 н. НСР . по достиже нию рН 4,60 - 4,66. Затем пробу молока оставляют при комнатной темпер туре 1,0-1,5 ч для отделения сыворо ки и центрифугируют при 1500 2000 об/мин 10-15 мин. Сыворотку сливают, а осадок используют для оп ределения активности протеиназы, связанной с мицеллами казеина. Для этого к 1,0-2,0 г казеина добавляют 2,0-2,5 МП казеин-сефарозы 4В,меченой флюорескамином, и 1,0 - 2,0мл 0,2 М трис-нее буфера рН 8,0-8,Т. Стеклянной палочкой аккуратно перем шивают всю реакционную смесь. Гидролиз проводят 18-22 ч при 37 - 38°С в стерильных условиях. По ле инкубации для получения прозрач32 . 4 . ных растворов и остановки гидролиза образцы центрифугируют при 3500 4000 об/мин 20-25 мин при О - - -4С. В прозрачном супернатанте измеряют флюоресценцию на флюориметре типа Хитачи. Активация и эмиссия раствора 390 и 475 нм соответственно. Для расчета активности протеолитического фермента молока строят калибровочную кривую по значениям флюоресценции растворов, полученных при гидролизе субстрата возрастающими количествами чистого препарата трипсина., В табл. 1 показано влияние условий реакции гидролиза КБЗ-аргинин-7-аминокумарина на активность протеиназы молока коров (в у трипсина). В табл. 2 показано влияние условий, реакции гидролиза, иммобилизованного на сефарозе 4Б казеина, меченого флюорескамином, на активность казеисвязанной протеиназы в молозиве коров через 24 ч. после отела. Предлагаемый способ апробирован на двух группах коров черно-пестрой породы 3-4 отела на 7 головах в зимний (группа I) и на 5 головах в летний стойловый периоды (группа U) , живым весом 450 - 550 кг, продуктивностью в предыдущую лактацию 4000-4500 кг. Животных содержали на общехозяйственном рационе, сбалансированном по основным питательным веществам.Образцы проб молозива и молока отбирали по схеме:через 1,3,5,7,8,15 и 24 ч после отепа; далее в течение последующих шести дней составляли среднесуточную пробу от трех удоев, а затем до 60 дня лактации - подекадную среднесуточную пробу. Подученные данные представлены в табл. 3. Протеолитическая активность, молозива коров, содержащихся на летнем рационе, уже через час после отела приблизительно на 70% выше, чем активность фермента в.молозиве коров, содержащихся на зимнем рационе.. В дальнейшем содержание протеазы в молозиве постепенно увеличивалось. Так через 5 ч после отела протеолитическая активность молозива коров, содержащихся на летнем рационе, возросла незначительно, а в молозиве коров, содержащихся на зимнем рационе, возросла на 60%. К концу первых суток активность протеолитического фермента в молозиве коров, содержащихся на летнем рационе, 5 бьщЭНа 65 % вьппе, чем в молозиве коров, содержащихся в зимнем рационе т.е. разница в величине активности, полученная в молозиве, отобранном через час после отела, сохранилась в течение первых суток. за семь дней лактации уровень протеазы в молоке коров обеих.групп возрос более чем в 6 раз и составил 20,2-10-3 у(1 группа) и 7,37.10-3 (П группа). Необходимо отметить, что содержание трипсиноподобного протеолитического фермента в моЛознве и молок коров обеих групп до 40iдня лактаци возрастало относительно равномерно. Затем за следующие 20 дней содержание фермента в молоке коров в летни период года возросло более чем в 60 раз, а в молоке коров, содержащихся на зимнем рационе, более чем в 600 раз. Кроме того, активность фермента, связанного с казеиновой фракцией молока, наивысшая уже через час посл отела, причем также как и общая протеолитическая активность .молока в 2 раза вьше у коров, содержащихся на летнем рационе. В противоположность содержанию фермента в молоке, активность казеин-связанного фермента за первые 24 ч после отела резко падает и к концу первых суток составляет около 3% от первоначальной величины 2 в молозиве коров 1 группы и молозиве коров П группы. За : следующие семь суток казеин-связанная протеолитическая активность достигала 0,17 и 0,07% соответственно. А к 40 дню лактации активность связанного фермента соизмерима с общей протеолитической активностью молока. В дальнейшем до 60 дня лактации сохраняется медленное снижение активности фермента адсорбированного на поверхности казеиновых мицелл, на фоне резкого повьшения общей протеолитической- активности молоке. Таким образом, впервые было проанализировано молозиво и молоко коров черно-пестрой породы, содержащихся на летнем и зимнем общехозяйственных рационах, и исследована динамика содержания трипсиноподобного протеолитического фермента, нахрдящегося как в свободной форме, так и связанной с мицеллами казеина. Предложенный способ.апробирован с положительным результатом на 400 образцах в лабораторных условиях. Предложенный способ, по сравнению с известнь1М является более эффективньм; имеет высокую чувствительность, сравнимую с чувствительностью радио-г активных способов; позволяет определить активность фермента во фракциях молока; сокращает время на его проведение; несложен по технике выполнения.

-

ю 00 о т

ю

о«-сч 4-(+ ч-Г4-1

ОО -t-t

00vOСЧГ-

г

00 со

00

го

(Л

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТЙЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОКА, предусматривающий обезжиривание молока. добавление специфического субстрата с последующим гидролизом его в присутствии буфера и оценкой степени гидролиза флюориметрически, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повьшения чувствительности способа, перед добавлением специфического субстрата из молока вьзделяют казеиновую фракцию, специфический субстрат вводят в обез жиренное молоко и в казеиновую фракцию, а определение протеолитической активности осуществляют в молоке и казеиновой фракции, при этом при определении протеолитической активности в молоке в качестве специфического субстрата используют карбоксибензоил-аргинин-7-аминокумарин солянокислый, W а в. казеиновой фракции - иммобилизованный на сефарозе 4В казеин, меченый с флюорескамином.. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что гидролиз проводят в присутствии буфера трис-НС8 0,2М, рН 8,0 - 8,5 в течение 18-22 ч. ND t О Од Ю

г-

го го

00

о

о

о

9,

м

ч

гч

см

сч

о

о

о

t

Г|

00

00

ОО

о00 о

CV4

см