Способ определения поверхностных белков легочной ткани Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

путем пропускания физиологического раствора через легочную артерию в течение 2-3 мин под давлени ем 30 см вод,ст. Затем доступ физиологического раствора прекращают и в течение 3 (1-я морская свинк;а), 1 (2-я) или 30 мин (3-я) через легочную артерию в том же режиме пропускают фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные объемы Э,6%-ного гл таральдегйда, 0,2 М какодилатногоi фера рН 5,6-6,0 и 0,3%-ного водного раствора проционоврго ярко-голубого H5GS. Далее материал обраба-f тывают по схеме, приведенной в описании способа. При электронно-микроскопическом изучении материала установлено, что трехминутная перфузия легкого фиксирующе-красящей смесью является недостаточной, так как продукт реак ции на поверхности альвеолярного эпителия выявлялся нерегулярно, в отдельных небольших участках срезов ткани. Этот недостаток устранен при 10- или 30-минутной перфузии легкого фиксирующе-красящей смесью Причем между этими сроками перфу|эии не выявлено существенных раз личий по степени выраженности и равномерности распределения продукта реакции. Поскольку при 30-минутной перфузии расходуется большее количество реактивов, что экономически мене выгодно, в качестве наиболее оптиМального выбрано времз перфузии 10-20 мин. П р и м е р 2. Легкие морской св ки отмывают от крови путем пропускания физиологического раствора через легочную артерию в течение 2-3 мин под давлением 30 см вод.ст Затем доступ физиологического раствора прекращают и в течение 10 мин через легочную артерию в том же режиме пропускают фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные объемы 3,6% глутаральдегида, 0.,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и 0,3% водного раствора проционового яркоголубого H5GS.. Затем вырезают несколько 5-6 см сегментов легочно ткани и помещ 1ют их в свежие порции фиксирукяце-красящей смеси на 30 мин, 1 или 2,5 t. Далее весь Ма териал обрабатывсшт по схеме, приведенной в описании способа. . При электронно-Микроскопическом изучении материала установлено, чт i30 мин не достаточно для полного проникновения фиксирующе-красящей смеси вглубь 5-6 см кусочков ткани, так как продукт реакции отчетливо выявляется только иа первых .ее срезах. При обработке 5-6 см Кусочков фиксирующе-красящей . смесью в течение 2,5 ч во многих клетках альваолярного эпителия обнаружено набухание митохондрий, что рассматривалось нами как артефакт фиксации, обусловленный длительным пребыванием материала в фиксаторе при комнатной температуре, необходимой для более быстрого проведения гистохимической реакции. При обработке 5-6 см кусочков в течение 1 ч фиксирующе-красящая смесь более равномерно проникает в толщу кусочков и не вызывает сильного набухания митохондрий в клетках. Поэтому 1-1,5-часовая обработка фиксирующекрасящей смесью кусочков данного размера выбрана как оптимальная. Примерз. Легкие морской свинки отмывают от крови путем пропускания физиологического раствора через легочную артерию в течение 2-3 мин под давлением 30 см вод.ст. Затем доступ физиологического раствора прекращают и в течение 10 мин через легочную артерию в том же режиме пропускают фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные объемы 3,б%-ног6 глутаральдегида, 0,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,0 и 0,3%-ного водного раствора проционового ярко-голубого H5GS. Вырезают; 5-6 см сегментов легочной ткани и помещают в эту же смесь сначала на 1 ч, апосле дополнительного измельчения кусочков до 1-2 см еще на.30 мин. Материал 10 мин промывают 0,1 М какодилатным буфером рН 7,3-7,4 и разделяют на три части (по 3-4 кусочка в каждой). Одну часть кусочков обрабатывают насыщенным водным раствором тиосемикарбазида 10 мин, другую - 30 мин, третью - 60 мин. Дальнейшую подготовку материала для электронной микроскопии проводят по общей схеме, приведенной в описании способа. При электронно-микроскопическом изучении материала установлено, что 10-минутная обработка кусочков тиосемикарбазидом не достаточна, так как продукт реакции на срезах выявляется главным образом в виде следов. Необходимо увеличить время промывания материала в -какодилатном буфере до 1 1,5ч (3-4 смены по 20-25 мин). В противном случае, при погружении кусочков в ОзОд, последний выпадает в осадок. Длительное промывание материала после 60мИнутной обработки тиосемикарбазидом не только увеличивает общую продолжительность предлагаемого способа -выявления белков легочного сурфактанта под трансмиссионным электронным микроскопом, но и приводит к дополнительному расходу какодилата Na для буфера, что нежелательно. Поэтому время обработки кусочков тиосемикарбазидом сокращено до 20-30-мин. Оно достато но для проведения гистохимической реакции хорошего качества и требует не более 15 мин для промывания мате риала в буфере, Пример4. В эксперименте ис пользовано четыре крысы. Под гекссаналовым наркозом вскры вают грудную клетку животного. Легк отмывают от кровки путем перфузии ф зиологического раствора через легоч ную артерию в течение 2-3 мин. Зате доступ физиологического раствора прекращают и в течение 10-15 мин через легочную артерию пропускают одну из двух фиксирующе-красящих смесей. Фиксирующе-красящая смесь В 1 содержит равные объемы 3,6%-ног глутаральдегида, 0,2 м какодилатног буфера рН 5,6-6,0 и О,2-0,3%-ного водного раствора проционового яркоголубого HSGS; (проперфузированы 2 крысы). Фиксирующе-красящая смесь № 2 в качестве красителя содержит 0,3%-ный водный раствор проционового ярко-голубого RS (проперфуэированы 2 крысы). Вся дальнейшая обработка материала подводится в соответствии с предлагаемым способом. При просмотре материала под трансмиссионным электронным микроскопом у крыс, легкие которых обрабатывают фиксирующе-красящей смесью 1, в составе сурфактантного альвеолярного комплекса выявлен мелкогранулярный продукт реакции, обладающий высокой электронно-оптической плотностью. В том случае, если легкие обрабатывают фиксирующе-красящей смесью 2, продукт реакции под . трансмиссионным электронным микроскопом не выявляется. 1 П р. и м е р 5. У крыс и морских свинок с экспериментально вызванньтм альвеолярным липопротеинозом вскрывают грудную клетку. Через надрез в предсердии в легочную артерию вводят иглу с наболдашником и в те чение 2-3 мин через малый круг кро.вообращения под давлением 25-30 см вод.ст. пропускают физиологический раствор. После того как легкие отмы ты от крови, доступ физиологическсиг раствора прекращают и в течение 1015 мин через легочную артерию пропу кают фиксирующе-красящую смесь, содержащую равные объемы 3,6% глутаро вого альдегида, 0,2 М какодилатного буфера рН 5,6-6,О,и 0,2-0,3% водног раствора проционового ярко-голубого Вырезают 5-6 см сегменты легочной ткани и помещают их в фиксирующе.красящую смесь сначала на 1 ч, а ;после дополнительного измельчения кусочков до 1-2 см, еще на 30 мин при комнатной температуре. Материал 10 мин промывают 0,1 М какодилатным буфером рН 7,3-7,4, помещают на 30 мин в насыщенный водный раствор тиосемикарбазида, затем вновь 15 мин промывают этим же буфером и в течение 30 мин дофиксируют 1%-ным ОЗО4 на 0,1 М какодилатном буфере рН 7,37,4 при комнатнойтемпературе. Кусочки легочной ткани в течение 1 ч обезвоживают в ацетонах восходящей концентрации, окиси пропилена и после 1,5 ч проЛитки в смеси окись пропилена+эпон-аралдит (1:1) при заключают в эпон-аралдит известным способом. В течение 24 ч материал находится в Термостате на для полимеризации эпоксидной смолы. Затем получают ультратонкие срезы толщиной 50-60 нм, которые просматривают в трансмиссионном электронном микроскопе без дополнительного контрастирования, I-. Предложенный способ позволяет определить на поверхности альвеолярного эпителия продукт гистохимической реакции проционового ярко-голубого H5GS в виде мелкогрануляр-с,; J ного материала, обладающего высокой электронно-оптической плотностью. .Появление крупных скоплений продукта реакции в просветах альвеол свидетельствует о развитии альвеолярного липопротеиноза, а частота их встречаемости в легком позволяет оценить степень выраженности заболевания у животного. По сравнению с известным, предлагаемый способ является более простым и позволяет сократить время, необходимое для определения поверхностных белков легочной ткани под трансмиссионным электронным микроскопом с 3 месяцев до 2-3 сут. Упрощение и повышение точности способа обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов в эксперименте, приводит к уменьшению экономических затрат на исследование .и может применяться в клинике для диагностических целей. Формула изобретения Способ определения поверхностных белков легочной ткани путем ее фиксг1- ции перфузией в легочные сосуды с последующим окрашиванием и электронно-микроскопическим изучением, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, фиксацию и окргииивание проводят в среде следующего состава: 0,2-0,3%ный .проционовый ярко-голубой H5GS. 3, глутаровый альдегид, 0,2 М какодилатный буфер рН 5,6-6,0, взятых в соотношении 1:1:1, при этом перфузию проводят в течение 10-15 мин под давлением 25-30 см вод«

79418828

ст, далее легочную ткань выдержим 1. Suelski К., Taiiaka Т,, Oda Т.,

аают в том же составе в течение 1,5-Iraraunou trastruaturaf study of sur-

2,0 ч и затем в насыщенном.раствораfactant system, destribution of

тиосемикарбаэида в течение 20-30 мин.specific protein of surface active

Источники информации,material in rabbit-Pund. Labor,

принятые BO внимание при экспертизе. 5Inyestig, 1977, V 37, p. 130.