Способ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях Советский патент 1981 года по МПК C12Q1/42 

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РАСПРЕдаЛЕНИЯ ГУАНИЛАТЦИКД1АЗЫ

1

изобретение относится к медицине, а именно к цитЪхимии, и може быть использовано для электронно-микроскопического выявления гуанилатциклазы.

Известен способ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях 1.

Однако такой способ позволяет получить только количественный анализ определения активности фермента и не обеспечивает возможности локализации и органной специфичности гуанилатциклазы в клетке в норме и патологии.

Цель изобретения - повышение точности способа и упрощение его.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа выявления распределения гуанилатциклазы в тканях последние инкубируют при температуре 30-34С в течение 5055 мин в среде, содержащей 80 мМ трисмадеатного буфера,13-14 мМ глюкозы, 1-2 мМ теофиллина,0,1-0,5 мМ ГТФ и 4 мМ Ва (HQ)I, затем Их обезвоживают, заливают в эпоксидную смолу и проводят электронную микроскопию .

Способ осуществляют следующим образом.

В ТКАНЯХ

Проводят фиксацию в 1%-ном глютаральдегиде на 0,05 М какодилатном буфере с 4,5%-ной глюкозой 1ч при комнатной температуре,рН фиксатора -.7,4.

Промывают в 0,05 М какодилатном буфере с глюкозой в течение 1 сут. На следукнций день производят отбраковку материала дляоптимального инку10бирования материала.

Инкубацию осуществляют при + 30 + 34°С в течение 50-55 мин (оптимальная продолжительность инкубации).

Для оптимизации выявления фермента были испробованы 6 вариантов инкубационной смеси.

В табл. 1 представлены материалы оптимизации температурного режима и время инкубации.

С помощью табл.2 установлено, что

20 для определения активности гуанилат -. циклазы в различных органах необхо- , ДИМ определенн1 й вариант.

Инкубационная смесь включает,мМ: трисмалеатный буфер 80

25 глюкоза13

теофиллин1 2

MnCIa0,1-0,5

Ъа(НО)4

30 Кроме предлагаемой иккубационной смеси, применяется инкубационная смесь, в состав которой помимо указа ных компонентов входит еще MaN -ази натрия, который является спёщифичесКИМ активатором гуанилатциклазы. Пос ле удаления азида натрия из инкубационной смеси активность гуанилатциклазы возвращается к норме. Для оптимизации выявления фермента с помощью активатора гуанилатцикл зы азида натрия были испробованы так же 6 вариантов инкубационной смеси которые приведены в табл.3. Например, для оптимального выделения фермента в клетках тонкого кишечника, печени и поджелудочной железы млекопитакяцих необходим 1V вариант инкубационной смеси, для оптимального выявления фермента в клет ках легких и сердца - ГГ вариант. Теофиллин -вводят в инкубационную смесь для ингибации фосфодиэстаразы (ФДЭ что способствует увеличению уровня цГМФ в клетке, необходимого для активации катализа ферментативной реакции ГТФ или гуанилилмидодифо фат - специфический субстрат выявления гуанилатциклазы. Ва(НО),- маркер выявления фермента. После инкубации производят быструю промывку материала в 0,08 м трисмалеатном буфере. Дриофиксацию в 1% OgO на 0,05 М какодиалатном буфере с глюкозой (,4) проводят в течение 1,01,5 ч при 4°С, прокывку - в 0,05 М какодилатном буфере с глюкозой (,4). Дегидратацию осуществляют в ацетонах возрастающей крепости (30, 50, 70, 96°, 100) и заливают в смесь чпона с аралдитом. Предлагаемый способ .при исследовании кусочков тканн из некоторых органов млекопитающих (тонкого кишечника, сердца, легких, печени, поджелудочной железы) позволяет определить строгую специфичность локализации гуанилатциклазы, а также установить ее видовую и органную специфичность, выявление гуанилатциклазы поможет вскрыть механизмы активации фермента как в физиологических, так и в некоторых патологических состояниях, что является чрезвычайно важным моментом в расшифровке проблем молекулярной биологии. Таблица 1

Фермент не

Фермент не выявляется выявляется

Слабая

Слабая реакция реакция выявления выявления фермента фермента

Слабая

Слабая реакреакцияция выявления ферменвыявленияфермента та

Реакция

Оптимальная неравнореакциямерная выявления фермента

13

80

1Г

13

80

Г1Г80

13

IV 80

13

13

80

13

VI 80

8%

80

1Г80

8%

Таблица 2

0,5 ОД

Фермент не выявляется

0,3

Оптимальная реакция для клеток сердца и легких

0,50,5

Слабая реакция во всех органах

0,1

Оптимальная реакция для клеток тонкого каучука, поджелудочной железы, печени

0,1 0,3

Слабая реакция во всех органах

Фермент не

0,1 0,5 выявляется

Таблица 3

0,5

Нет

0,5 0,1

Оптималь0,3 ная реак- ция для клетоЛ сердца и легких

ГП 80

0,5 0,5

8%

IV 80

8%

0,1 0,1

8%

0,3 0,3

80

8%

0,5 0,5

vr 80 Формула изобретения Способ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях, о т л ичающ-ийся тем, что, с целью вышения точности способа и упрощения его, ткани инкубируют при темпе ратуре 30-34С в течение 50-55 мин в среде, содержащей 80 мМ трисмалеатного буфера, 13-14 мМ клюкозы, 1-2 мМ теофиллина, 0,1-0,5 мМ ГТФ

Продолжение табл. 3.

Слабая реакция во всех органах

Оптимальная реакция для клеток пищеварительнойсистемы

Слабая реакция во всех органах

Нет и 4 мМ Ba(NOj)i3 затем из обезвоживают, заливают в эпоксидную смолу и проводят электронную микроскопию. Источники информации принятые во внимание при э кспертизе 1. Schultz G., Hardman J.G, et а 1 I A new enzymattc assay for guanosine 3,5-cyeIic monophosphate and its application to the ductus referens of the rat. Proc. Nat 1 . Acad, Sci. USA. 1973, T. 70, 6, c. 1721-1725.