Способ получения меченого белка Советский патент 1982 года по МПК A61K51/08 C07K17/02 A61K101/00 A61K103/00 A61K123/00 

(З) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕ ННОГО БЕЛКА

Изобретение относится к улучшенному способу получения меченного белка, биологически активного соединения, которое южет найти применение в биологии и медицине для радиационной диагностики различных заболеваний.

Известны меченные.белки, которые различаются природой изотопа, обуславливающего радиоактивность, и методами введения данного изотопа в молекулу белка. Наиболее широко известны способы промемивания белков изотопами иода - 125) и ,131J являющимися у-источниками .11 и 2.

При этом введение радиоактивного иода осуществляют либо непосредственно в аминокислотные остатки белка, содержащие ароматические группы, либо химической модификацией различных реакционных центров белка специальными реагентами, содержащими изотопы иода.

Несмотря на то, что техника регистрации -излучения проста, работа с изотопами иода неудобна из-за их малого периода полуспада. Кроме того, включение иода в белковую молекулу часто приводит к нарушениям структуры молекулы белка, в частности к изненению антигенной специфичности.

Известны способы введения в белок долгоживуцих изотопов трития и углеро10да- Т, обладающих мягким 5-излучением.

Например, описан способ получения радиоактивного препарата белка реакцией восстановительного алкилирования

15 с использованием .С-Лормальдегида. По этому способу на первой стадии реакции происходит взаи -юдейстпие формальдегида с Е-аминогруппами, лизина ° белка с образованием лабильных оснований Шиффй. Вторая стадияреакции заключается в восстановлении лабильных оснований Пиффа до стабильных метиль396803ных групп при помощи боргидрида натрия. Обработка белков данным способом осуществляется при рН близком к в температуре около 3. Недостатком метода яЪляется узкий j диапазон значений рН и температуры обработки белка, связанный с неустойчивостью боргидрида натрия. При помо-. щи метода восстановительного алкилиро-г вания с использованием боргидрида нат-Ю рия можно променивать только ограниченный круг белков, стабильных именно при данных строгих параметрах обработ ки. . . , . . Наиболее близким к предлагаемому является апр(соб получения меченных тритием или углеродог- -1 белков, который состоит в обработке белка радио Ьктивным формальдегидом с последующи) восстановлением образующихся лабильных оснований Юиффа до стабильных соединений цианоборгидридом натрия ,, NotBHjCN .6N Этот способ позволяет проводить реакцию восстановления при нейтральных значениях рН и иироком температурном интервале (от , до 37°С), что позво:Ляет расширить номенклатуру белков, способных к промачиванию при указанных режимах обработки t. Известные способы обработки белков реакцией восстановительного алкилирования с использованием в качестве восстанавливающих агентов боргидрида и цианборгидрида натрия дают возможность получать меченные белки, сохраняющие антигенную специйичность, с удельной радиоактивностью 0,,0 мкК /г белка, которая,однако,часто недостаточна для тестирования микроколичеств белка, с которыми приходится иметь дело в биохимических исследованиях. Вследствие того, что радиоактив ность меченного препарата определяется количеством С-формальдегида, необратимо связанного с аминогруппами белка, данный метод не позволяет получать препараты с большей удельной радиоактивностью, чем указано выше, без наруиения антигенной специфичности белка. Изменения в структуре белка при использовании значительных количеств формальдегида и, особенно, .восстанавливающих агентов, обусловле4|ны,во-первых, блокированием большого числа -аминогрупп белка, а во-вторых способностью боргидрида и цианборгидрида натрия восстанавливать не только основания (Ьфа, но и карбоксильные группы, сульфидные связи, определяющие стабильность конформации белка. Целью изобретения является повышение удельной радиоактивности промечиваемого белка при сохранении.его антигенной специфичности. . Поставленная цель достигается тем, что со| ласно способу получения меченного белка с помощью формальдегида, заключающемуся в том, что формальдегид подвергают взаимодействию с алифатической аминокислотой, меченной тритием или углеродом-1, и образующимся при этом производным общей формулыR- СН-СОО-Н I N CHij где Г ал кил или С-алкил, обрабатывают белок в водном буферном растворе при рН 5,5-10,0 и температуре , при молярном соотношении компонентов формальдегида, аминсжислоты и белка О, ,ОбО:1 ,9x10 . . Предпочтительными вариантами, проведения процесса являются использование в качестве водного буферного раствора фосфатного и боратного буферов; в качестве алифатической аминокислоты используют Н-лизин, И-глицин %-лейцин. . Предлагаемый способ позволяет получить белок с удельной радиоактивностью 120-909 мкК/мг белка. Антигенная специфичность белка, промеченных путем восстановительного алкилиррвания в указанных концентрационных параметрах формальдегида и восстановителя, также практически не изменяется. Однако нельзя получить более высокопромеченные препараты белков методом восстановительного алкилирования формальдегида без серьезного нарушения антигенной специфичности. Для экономного расходования радиоактивных аминокислот, белков и прочих материалов важное значение имеет возможность получения высокопромеченных белков с заданной удельной радиоактивностью путем варьирования удельной радиоактивности или концентрации аминокислот (.фиг. 1и пример 2,3). Из табл, 2 также видно, что с увеличением температуры возрастает удель ная радиоактивность промечюваемого белка. Однако для конкретного белка имеется верхний предел температурного режима обработки, связанный с дeнatypaциoнными процессами,. Установлено, что существует определенное значение рН, зависящее от .природы конкретного белка, при котором удельная радиоактивность промечиваемого предлагаемым способом белка достигает максимального значения (фиг. 2К. . На фиг. 1 представлена зависимость величины удельной радиоактивности миоглобина, промеченного предлагаемым способом, от концентрации используемой радиоактивной аминокислоты, в частности моногидрохлорида И-лизина на фиг. 2 - зависимость величины удельной радиоактивности (а ) миоглобина и (б ) бычьего сывороточного альбумина, меченных предлагаемым способом, от величины рН среды. ; -Совокупность отмеченных преимущест способа промечивания белков обеспечивает возможность создания ряда отеЧественных комплектов препаратов для радио.изотопного анализа в биохимических ив медицинских исследованиях, например для диагностики инфаркта миокарда и т.д. Общая схема получения меченного белка., К 0,1 мл раствора радиоактивной коммерческой алифатической аминокислоты требуемой удельной радиоактивности или концентраций добавляют последовательно 0,01 мл 0,9-1,2 М раст эора формальдегида (оптимально 1,12 d 0,1 мл раствора белка концентрации 0,08-0,20 мг/мл. Реакцию белка с лабильными производными формальдегид и алифатической аминокислоты, образующимся практически мгновенно при их смешении, проводят в течение су так как за это времч, согласно кинетическим измерениям, взаимодействие практически заканчивается. Процесс промечивания проводят при соответствующем значении рН от 5,5 до 10,0 задаваемым в области рН 8,0-10,0 боратным буфером, а в области 5,5-8,0 фосфатным буфером, и температуре 20-48°С Режим обработки р(Г и температура огра ничиваются областью устойчивости каждого конкретного белка. Меченный белок отделяют от низкомолекулярных компонентов элюированием через хроматографическую колонку с сет фадексом или посредством диализа. Удельную радиоактивность белка опре- ; деляют нанесением пробы объемом 0,02 МЛ наг мембранный фильтр Сынпор с последующим просчитыванием (Ь-излучения и толуольном ацинтилляторе на сцинтилляционном счетчике. Пример 1. Для получения меченного тритием человеческого миогло;бина взято на 1 мг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности kQ,0 К/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/мл. Режим обработки: рН 10,0 и температура 20С. В результате промечивания полу1иен белок с удельной радиоактивностью 50,0 мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электроосмофорезе составлял 1:25б, титр нативного белка 1:25б. Примеры 2 и 3. Для получения сравнительных данных по влиянию на удельную радиоактивность человеческого миогло(5ина удельной радиоактивности и концентрации используемой аминокислоты, взято на 1 мг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности соответственно ,0 К/мН и (0,25 К/мМ с радиоактивной концентрацией в обоих случаях 1,0 мК/мл. Режим обработки: pfl 7,9и температура . В результате промечивания получены белки с удельной радиоактивностью соответственно 617,0 мкК/мг и 175,0 мкК/мг. Титры меченных белков в обоих случаях во встречном электроосмофорезе. составляв Ьи 1:256, титр исходного белка также 1:256. Пример 4. Для получения меченного тритием бычьего сывороточного альбумина взято на 1 мг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 0,0 К/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/ /мл. Режим обработки: рН 5,5 и температура 25®С. В результате промечивания получен белок с удельной радиоактивностью 273«0 мкК/мг.Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител составлял 1:f096, титр исходного белка . Пример 5. Для получения меченного углеродом-1 бычьего сыаороточного альбумина взято на 1 мг белка 10,0 мК С-лейцина удельной радио активности 5«0 K/м и радиоактивной концентрации 1,0 . Режим обработки: рН 9,0 и температура . В результате промечивания получен белок с удельной радиоактивностью 291,0 мкК/мг. Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител состав лял 1:409б, титр нативного белка . Пример 6. Для получения меченного по тритию бычьего сывороточного альбумина взято на 1 мг белка

Челове25 7,0 ческий миоглобин

0,058 0,2П 10,0 мК моногидрохлорида Эн-лизина удельной радиоактивности kQ,Q к/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/ /мл. Режим обработки: рН 9,0 и температура 8°С. В результате промечивания получен белок с удельной радиоактивностью 909,0 мкК/мл. Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител составлял 1:409б, титр исходного белка 1 . В приведенных табл. 1 и . даны конкретные примеры составления реакционн }1х смесей для получения меченного белка. Таблица 1

1

То же

10,0 20

37 7,9

37 7,9

Бычий

25 7,0 сывороточныйальбумин

То же

25

5,5

II

37 9,0

Примечание. Числитель - удельная радиоактивность, К/мМ.

Знаменатель - радиоактивная проба, мК/мг белка.

0,058 0,20

НатиоТо же ный белокПример 7. Получение меченного человеческого миоглобина при исполь зовании формальдегида с концентрацией меньшей нижнего предела. Для получения меченного тритием человеческого миоглобина взято на 1 кг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 0,0 К/ /мМ и радиоактивной концентрации 1,0 , при этом концентрация белка в пробе составляла 10,0 мкг. Режим обработки: рН 10,0 и температура 20°С Концентрация используемого формальдегида 0, М. В результате промечивания в течение 4 сут получен белок с удельной радиоактивностью 280 мкК/мг, в течение 8 сут мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электроocMO(bope3e составлял 1,25б, титр нативного белка - .i Пр и м е р 8. Получение меченно- го бычьего сывороточного альбумина при

Таблица 2

1:256 использовании формальдегида с концентрацией большей верхнего предела.. Для получения меченного тритием бычьего сывороточного альбумина взято н.э Гкгбелка 10,0 мК моногидрохлорида К-лизина удельной радиоактивности 0,0 К/мМ .и радиоактивной концентрации 1,0 мК/mi, при этом концентрация белка в пробе составляла 10,0 мкг. Режим обработки: рН 5,6, температура 25°С. Концентрация используемого формальдегида 0,08 М. В результате промечивания в течение 2 сут получен белок с удельной радиоактивностью 120 мкК/мг, в течение V сут 70 мкК/мг. Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител составляет: через 2 сут ийкубации 1: , через Л сут - 1:102. Титр нативного белка - 1: +096. Пример 9. Использование Н-глицина в качестве меченной аминокислоты. Для полумения меченного тритием человеческого миоглобина взято на 1 мг.белка 12,5 мК, Н-глицина удельной радиоактивности 19,0 К/мМ и радиоактипной концентрации 1,0 мК/мл, при i этом концентрация белка в пробе составляла 8,0 мкг. Режим обработки: рН 8,0 и температура 37°С. В результате промечивания получен белок с удельной радиоактивностью 310 мкК/мг Титр меченного белка во встречном электроосмофорезе составлял 1:256, Титр нативного белка: 1:25б. Пример 10, Использование Н-глицина в качестве меченной амино- 15 кислоты. Для получения меченного тритием человеческого миоглобина взято на 1 мг. белка 5,0 мМ Н-глицина удельной радиоактивности 19,0 К/мМ и радиоактив- 20 ной концентрации Т 1,0 мК/мл,,при этом концентрация белка составляла 20,0 мкг в пробе,. Режим обработки: рН 8,0 и температуре . В результате промечивания получен белок с удельной 25 радиоактивностью 130 мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электроосмофорезе составлял 1:526, титр нативного белка - 1:256. Сохранность антигенной спёцифич- до ности человеческого миоглобина проверена во встречном электроосмофорезе, сохранность антигенной специфичности бычьего .сывороточного альбумина проверена в реакции нейтрализации анти- jj тел. Данные табл. 2 показывают, что по сравнению с известным способом значительно увеличивается удельная радиоактивность белков, промеченных пред- о лагаемым способом, что позволяет npo-t водить биохимические и медицинские исследования с меньшими концентрациями белков. Так получен Н-миоглобин высокой удельной радиоактивности без нарушения его антиге+нной специфичности. На основе этого препарата метод радиоиммунологического определения уровня миоглобина в ыворо,тках позволяет определятьмиоглобин в концентрации не менее 15 х 1(. В результате параллельного определения уровня миоглобина в сыворотках больных и здоровых людей с помощью импортного набора (Sorin Biomedica, Италия) и с помощью описываемой петодики, где меченным антигеном является Н-миоглобин, оказалось. что ны рал опр рот пол гло Нмымка ча пов бел спе ют нок лер про ,где полученные результаты сопоставле(табл. 3). В табл. 3 приведены результаты палельного радиоиммунологического еделения уровня миоглобина в сывоках больных инфарктом миокарда, ученные при использовании J-миобина (Sorin Biomedica, Италия) и миоглобина, .промеченного предлагаеспособом. Таблица 3 Формула изобретения 1. Способ получения меченного бел с помощью формальдегида, отлиющийся тем, что, с целью ышения удельной радиоактивности ка при сохранении его антигенной цифичности, формальдегид подвергавзаимодействию с алифатической амиислотой, меченной тритием, или. одрм-Н и образую1цимся при этом изводным общей формулы |-сн-соои Н-СН е - . И - алмил илис-алкил,

13

оОрае)атывают белок в водном буферном pacTUope при рН 5, и температуре при молярном соотношении формальдегида, аминокислоты и белка 0,,0(0:1,9x10 -4x10 :

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

И

to a 125J-containinq acylatinq agent. AppFication to the radToimmunoassay. Biochem. J. 1973 , U3, 3, 529.

t. Dottarlo-Martln D., Ravet J.Mj Radiotabefting of proteins by reductive aFkytation with € -formaМёhyde and sodium cyanoborohydride AnaP. Biochen. 1978, 87, N 2, c. 5б2 (прототип).

s

678

10 рН

Фнг.1