N-ОКСИСУКЦИНИМИДНЫЕ ЭФИРЫ N-АЦЕТИЛТИРОНИНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТОВ ДЛЯ СИНТЕЗА КОНЪЮГАТОВ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ С АЛЬБУМИНОМ Советский патент 1994 года по МПК C07D207/404 

Предлагаются новые химические соединения, конкретно N-оксисукцинимидные эфиры N-ацетилтиронинов общей формулы I
где
в случае тироксина или

в случае трийодтиронина.

Указанные соединения могут найти применение в качестве полупродукта для синтеза конъюгатов тиреоидных гормонов с альбумином.

Известны аналоги заявляемых соединений формул II и III
X
и
X где Х - имеет указанные значения.

Недостатком аналогов формулы II является отсутствие в их структуре активированной карбоксильной группы. Получение конъюгатов на их основе состоит в получении метиловых эфиров исходных тиронинов и смешивании их с раствором белка в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК), активирующего в данном случае карбоксильную группу белка (в частности, альбумина).

X X X
Конъюгат формулы IV имеет низкую степень конъюгирования, составляющую 11-16 молекул гаптена на 1 молекулу альбумина. Это связано с тем, что взаимодействие с белком осуществляется непосредственно в присутствии ДЦГК, что в свою очередь приводит к образованию большого числа ковалентных связей между самими белковыми молекулами и соответственно - к уменьшению количества свободных карбоксильных групп на белке. Данное обстоятельство и является причиной низкой степени конъюгирования. Известно, что повышение степени конъюгирования способствует более эффективной выработке антител. Кроме того, на первой стадии получения конъюгатов может происходить частичное дейодирование исходных соединений. Таким образом, аналог формулы II по существу представляет собой трудноразделимую смесь родственных соединений, отличающихся содержанием йода в молекулах гормонов, что и приводит в конечном итоге к конъюгату IV, продуцирующему антисыворотку с низкой специфичностью.

Получение антигенов на основе аналогов формулы III предполагает получение метиловых эфиров исходных тиронинов, введение карбоксилсодержащей функции, активацию карбоксильных групп с помощью дициклогексилкарбодиимида в присутствии N-оксисукциимида, смешивание образующихся при этом активированных эфиров формулы III с водным раствором белка и выделение целевых антигенов формулы V по схеме
X X + H₃CN _______→
X X
X
Получение антигенов на основе аналогов формулы III включают в себя четыре стадии химических превращений. Однако уже первая стадия этерификации смесью СН₃ОН/HCl приводит к частичному дейодированию гормонов. В результате также образуется трудноразделимая смесь родственных соединений формулы III, отличающихся содержанием йода в молекулах гормонов. Хотя конкретные данные по использованию конъюгатов формулы V, имеющих высокую степень конъюгирования, для выработки у животных антител к тиреоидным гормонам в литературе не приводятся, очевидно, что данный конъюгат формулы V также будет продуцировать антисыворотку, хотя и эффективно, но с низкой специфичностью. Такая сыворотка не пригодна для использования в радиодиагностических наборах.

Цель изобретения - изыскание новых производных тиронинов, позволяющих получать новые конъюгаты тиреоидных гормонов с альбумином, имеющих высокую степень конъюгирования и продуцирующих антисыворотку с высокой специфичностью.

Указанные полезные свойства определяются химической структурой N-оксисукцинимидных эфиров N-ацетилтиронинов, которые выражаются общей формулой I. Способ получения предлагаемых соединений заключается в том, что исходные тиронины ацетилируют с помощью N-оксисукцинимидного эфира уксусной кислоты в этиловом спирте и вводят в реакцию с дициклогексилкарбодиимидом в присутствии N-оксисукцинимида, выделяя заявляемое соединение.

XHCOO ______→ X

Строение полученных соединений подтверждено элементным анализом и ИК-спектром.

П р и м е р 1. Получение N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтироксина.

Растворяют 50 мг (64 мкмоль) тироксина в 15 мл этилового спирта и добавляют 30 мг (190 мкмоль) N-оксисукцинимидного эфира уксусной кислоты, перемешивают 20 ч при комнатной температуре, рН 8,5. Этиловый спирт упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 0,1 н. НСl, водой, высушивают Na₂SO₄ и упаривают в вакууме. Получают 50 мг (95,0% ) N-ацетилтироксина, аморфного хроматографически однородного.

R_f в системе этилацетат/метанол (8: 2) 0,84, в системе этилацетат/метанол (8: 1) 0,52.

ИК-спектр (ν, см^-1): 1650, 1735, 3400-3500.

Растворяют 50 мг (61 мкмоль) N-ацетилтироксина в 4 мл этилацетата, добавляют 10 мг (87 мкмоль) N-оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0^оС и по каплям добавляют 14 мк (67 мкмоль) дициклогексикарбодиимида в 2 мл этилацетата, перемешивают 1 ч при 0^оС и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, этилацетатный раствор промывают последовательно 1 н. NaHCO₃ водой, высушивают Na₂SO₄, упаривают в вакууме. Получают 50 мг (90,0% ) N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтироксина, т. пл. 188-189^оС (этилацетат/гексан), мол. м. 916,0.

Найдено, % : С 27,53; Н 1,68; N 3,01.

С₂₁Н₁₆О₇N₂J₄
Вычислено, % : С 27,51; Н 1,75; N 3,06.

П р и м е р 2. Получение N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтрийодтиронина.

Растворяют 250 мг (0,406 ммоль) трийодтиронина в 60 мл этилового спирта и добавляют 78,5 мг (0,5 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира уксусной кислоты. Проведение реакции и выделение целевого продукта осуществляют, как в примере 1. Получают 250 мг (94,0% ) N-трийодтиронина, аморфного, хроматографически однородного. Растворяют 250 мг (0,360 ммоль) N-ацетилтрийодтиронина в 10 мл этилацетата, добавляют 57,5 мг (0,5 ммоль) N-оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0^оС и по каплям добавляют 82,4 мг (0,4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 4 мл этилацетата. Ведут реакцию и выделяют продукт, как в примере 1. Получают 250 мг (87,7% ) N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтрийодтиронина, т. пл. 152-154^оС (абсолютный этиловый спирт), мол. м. 790,0.

Найдено, % : C 31,87; H 2,07; N 3,51.

C₂₁H₁₇O₇N₂J₃
Вычислено, % : C 31,90; H 2,15; N 3,54.

Соединения формулы I являются необходимыми компонентами для получения конъюгатов тиреоидных гормонов с белком и представляют собой первое звено технологической цепи: тиреоидный гаптенконъюгат - антитела к тиреоидным гормонам - диагностический набор для определения гормона.

Использование соединений формулы I в синтезе конъюгатов тиреоидных гормонов с белками имеет преимущества по сравнению с использованием для этой цели аналогов формул II и III. Конъюгаты формулы VI, полученные на основе соединений формулы I, обладают высокой степенью конъюгирования, составляющей 46-48 молекул тиреоидного гаптена на 1 молекулу альбумина в отличие от конъюгатов и позволяют вырабатывать антисыворотку с высокой специфичностью в отличие от конъюгатов формул IV и V. Кроме того, способ получения новых конъюгатов формулы VI из заявляемых соединений формулы I на стадию короче способа получения конъюгатов формулы V, так как конъюгирование тиреоидных гаптенов с белками происходит по имеющейся карбоксильной группе в гаптенах, а не введенной дополнительно химическими методами
XH₃COO ______→ X
X
Получение конъюгатов формулы VI из заявляемых соединений подтверждается примерами конкретного выполнения. Свойства новых конъюгатов формулы VI подтверждены актом испытаний.

П р и м е р 3. Конъюгат N-ацетилтироксина с альбумином.

Растворяют 50 мг (64,2 мкмоль) N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтироксина в 5 мл диоксана и прибавляют 50 мг (0,72 мкмоль) бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 5 мл воды (рН 8,35, 0,1 М раствор NaHCO₃), перемешивают в течение 20 с при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 36 ч, лиофилизуют. Определение степени конъюгирования тиреоидного гаптена с БСА проводят спектрофотометрическим методом. Для этого измеряют поглощение конъюгата в области 300 нм, обусловленное в основном поглощением гаптена, и вычитают вклад поглощения белка в эту спектральную область. На основании предварительно найденного коэффициента экстинкции тиреоидного гаптена рассчитывают концентрацию гаптена в растворе и относят ее к известной концентрации белка. Для проверки достоверности расчета степени конъюгирования с БСА были использованы радиоактивные гаптены с известной удельной радиоактивностью. Разница в определении по двум методам не превышала 5-8% . По данным спектрофотометрических измерений на 1 молекулу БСА приходится 48 молекул N-ацетилтироксина.

П р и м е р 4. Конъюгат N-ацетилтрийодтиронина с альбумином.

Растворяют 50 мг (76,98 мкмоль) N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтрийодтиронина в 5 мл диоксана и прибавляют 50 мг (0,72 мкмоль) БСА в 5 мл 0,1 М раствора NaHCO₃, рН 8,35. Условия проведения реакции и выделения целевого продукта, как в примере 3. По данным спектрофотометрии на 1 молекулу БСА приходится 46 молекул N-ацетилтрийодтиронина. Испытания новых конъюгатов формулы VI, полученных из соединений формулы I проводят в сравнении с известными конъюгатами формулы IV, которые являются лучшими, применяемыми для радиоиммунологического анализа тиреоидных гормонов.

В ходе испытаний определяют иммуногенные свойства конъюгатов тиреоидных гормонов с альбумином, т. е. способность заявляемых соединений вызывать при введении в организм животного образование за определенный промежуток времени антител к тиреоидным гормонам, и изучают характеристики полученных антител.

Иммунизация кроликов конъюгатом ацетилтироксина с альбумином.

Конъюгат (1 мг), содержащий 48 молекул тироксина на 1 молекулу альбумина, растворяют в 0,5 мл физиологического раствора и прибавляют 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда. Смесь тщательно гомогенизируют и с помощью медицинского шприца вводят кролику. Процесс иммунизации состоит из нескольких циклов. Первый цикл включает трехкратное введение конъюгата подкожно во множество точек спины животного. Второй и последующие циклы состоят из однократного введения антигенного материала в той же дозе, что и в первом цикле. Взятие крови для тестирования антител проводят на 8-10 день после введения конъюгата. После дефибринирования и отделения форменных элементов крови получают сыворотку, содержащую антитела к тироксину (антисыворотку).

Иммунизация кроликов конъюгатом ацетилтрийодтиронина с альбумином.
Антисыворотку к трийодтиронину получают, как описано выше, но вместо конъюгата тироксина с альбумином используют конъюгат трийодтиронина с альбумином, имеющий 46 молекул трийодтиронина на 1 молекулу альбумина.

Определение характеристик полученных антител.

С помощью стандартных методик определяют следующие характеристики антител: титр (величина, характеризующая концентрацию антител в сыворотке и определяемая тем наибольшим разведением антисыворотки, при котором связывается 50% меченого антигена); специфичность (относительная реакционная способность тироксиновых антител к трийодтиронину и трийодтирониновых антител к тироксину).

Было установлено, что уже через месяц после начала иммунизации достигается активность антител, достаточная для целей радиоиммунного определения тироксина и трийодтиронина. После второго цикла иммунизации достигаются титры 1: 15000 и 1: 12000 для тироксиновых и трийодтирониновых антител соответственно.

При использовании известных конъюгатов формулы IV максимальный титр тироксиновых антител составляет 1: 4000, а трийодтирониновых 1: 2000.

Относительная реакционная способность тироксиновых антител к трийодтиронину составляет 0,8% , а относительная реакционная способность трийодтирониновых антител к тироксину 0,02% . По литературным данным эти величины равны 2-3% и 0,2-0,4% соответственно.

Таким образом, иммунизация животных конъюгатами, полученными на основе заявляемых соединений, уменьшает время образования антител (усиливает динамику их продуцирования) и увеличивает значение их максимальной концентрации (титр) по сравнению с известными конъюгатами формулы IV.

Получаемые антитела обладают высокой специфичностью и могут использоваться для радиоиммунологического определения тироксина или трийодтиронина. (56) Полевая О. Ю. , Ковалев И. Е. Принципы синтеза конъюгированных антигенов. Химико-фармацевтический журнал, т. ХII, N 2, 1978, с. 8-23.

Резников А. Г. Методы определения гормонов. Киев: Наукова думка, 1980.

Uliman E. F. , Josheda K. A. , Blakemore J. I. , Maggio E. and Liute R. Mechanism of inhibition of malate dehydrogenase by thyrosine derivatives and reactivation by antibodies Biochim. Biophys. Acta, 567, 1979, 66.74.

Чард Т. Радиоиммунологические методы. М. : Мир, 1981.

Garrett E. R. , Suzuki T. , Weber D. I. The acidic solvolytic transformations of on iodinated nucleoside the antivical 5-iodo-2^l-deoxyuridine. Soc. , J. Amer. Chem. 86, 1964, 4460.

N-Оксисукцинимидные эфиры N-ацетилтиронинов общей формулы

где

или

в качестве полупродуктов для синтеза конъюгатов тиреоидных гормонов с альбумином.