Способ получения антисыворотки к катехоламину Советский патент 1984 года по МПК A61K38/38 

со

Слд СО

Изобретение относится к иммунохимии, в частности к способам получения антител к катехоламинам, и может быть использовано в медицине, диагно стической и исследовательской работе Известен способ получения антисыBopoTioi к катехоламину.путем иммунит зации животного антигеном, представлякмцим собой катсхоламин, фенильное ядро которого ковалентно связано с полипептидом или протеином U. Недостатками данного способа явля ются низкие специфичность и сродств получаемых антител к катехоламину. Известен также- способ получения антисьторотки к катехоламину путем иммунизации животного антигеном, ковалентно связанным с носителем, при этом аминогруппа катехоламина ковалентно связана с карбоксильной группой белка или полипептида 2J. Однако известный способ позволяет получить антитела к катехоламину, обладакщие низкими специфичностью и сродством, поскольку в используемом для иммунизации конъюгированном антигене остаток катехоламина близко расположен к антигенным детерминантам белка или полипептида, взятых в качестве носителя целевого антигена. Целью изобретения является повышение специфичности целевого продукта. Цель достигается тем, что согласн способу к катехоламину путем иммунизации животного антигеном, ковалентно связанным с носителем, с последую щим забором крови и выделением из нее антисьшоротки, в качестве интиге на используют остаток катехоламина, ковалентно связанный с белком-носите лем по следующей формуле . НН К - I -. (СН РУ - I -Б где К остаток катехоламина, со держшций первичную амино группу; остаток антигенного белка-носителя. алифатическа:я цепочка; В качестве белка-носителя исполь зуют сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или гемоцианин улитки Пример. Синтез конъюгата осуществляют с помощьп сочетающего реагента - глутарового альдегида. В качестве антигенных носителей используют бычий сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин и гемоцианин улит ки. В 5 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 растворяют 5 мМ катехоламина, например норадреналина, дофамина, дофа или норметанефрина, в 0,001 мМ белка-носителя. В этому раствору прибавляют при постоянном перемешивании по каплям 2 мл 0,05 М раствора глутарового альдегида. По истечении 30 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 0,2 мл 0,2 М раствора глутарового альдегида. Реакционную смесь перемешивают 3ч, затем к ней приливают 0,2 мл 1%-ного раствора боргидрида натрия и оставляют при комнатной температуре 1 ч.. Далее раствор диализуют против физиологического раствора 24 ч при . Содержание связанного катехоламина в конъюгатах оценивают радиационным методом с применением меченого тритием катехоламина и спектрофотометрическим методом. Иммунизацию кроликов проводят по следующей схеме: первую инъекцию (0,1 мл смеси равных объемов полного адъюванта Фрейнда и раствора антигена с концентрацией 1 мг/мл) делают в лимфатический узел бедра задней лапы. Через 3 недели 0,5 мл смеси вводят внутрикожно во множество точек в область шеи. Затем через 2 недели инъецируют смесь с неполным адъювантом Фрейнда (1 мл) внутримышечно в бедро задней лапы. Последующие инъекции (0,5 мл смеси с неполным адъювантом) проводят внутрикожно с месячным интервалом. Через 7 дней после введения антигена производят забор крови. Полученную антисыворотку инактивируют нагреванием при 30 мин, разделяют на аликвоты и хранят при -20С. Антитела к катехоламину идентифицируют методами встречной двухмерной диффузии и по связыванию сыворотками радиоактивного катехоламина по способу, согласно которому к 50 мкл сыворотки в 0,1 мл 0,1 М трис-буфера рН 7,5 добавляют 3,4 нг меченого тритием катехоламина и инкубируют при 4°С 3 ч. Радиационную смесь разделяют на колонке с сефадексом G -25, о применяя в качествеэлюента 0,1 М трис-буфер рН 7,5, Фракщ1И (по 1 мл) смешивают с 10 мл сцинтилляционного раствора Брея и измеряют радиактивНОСТЬ в жидкостном СЦИНТШ1ЯЦИОННОМ спектрометре. Контролем служит сьгооротка интактного кролика. Титры антител определяют путем ин кубации фиксированного количества меченого тритием катехоламина с сери ей двухкратных разведений антисыворотки. Для разведения применяют 0,02 М фосфатный буфер рН 7,4, содержащий 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Методика определения титров, специфичности и сродства антител следую щая. К 100 мкл антисыворотки соответствукщего разведения добавляют 0,34 нг меченого тритием катехоламина в 0,1 МП 0,2 М фосфатного буфера рН 7,4 и 0,3 мл 0,5 %-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, содержащего 0,9% хлористого натрия и 0,05 % кроличьего гаммаглобулияа. Смесь перемешивают и инкубируют 12ч при 4С. Связанный меченый тритием катехоламин осаждают добавлением 0,5 мл Э0%-ного раствора полиэтиленгликоля и удаляют центрифугированием при 3000 об/мин 40 мин.,. К 0,2 мл над оса очной жидкости добавляют 10 мл раствора Брея и просчитывают на сцинтшшяционном счетчике. Иаксималь ное разведение антисыворотки, при котором связьшание меченого тритием катехоламина составляет 15%, приннмают за титр .антител к катехоламиНу Для оценки перекрестной реактивности антител используют известный прием ингибирования связывания анти сывороткой меченого гаптена его род ственными соединениями. Специфичнос антисыворотки оценивают путем добав- ., ления аналогов, например, к норадр«налину, таких как дофамин, дофа и норметанефрин. Определение связывающей способности антител проводят методом сатурационного анализа, Для количественной оценки процесса взаимодействия антител с катехоламином используют значения констант ассоциации (Касс, М), вычисление которых производят исходя из графика Скэтчарда. Результаты исследования обраба-гаваютметодом вариационной статистики по Стьюденту-Фишеру. Положительные качества получаемых предлагаемым способом антител к катехоламину представлены в табл. № 1. .Перекрестная реактивность, которая характеризует специфичность антител, получаемых предлагаемым способом, ниже, чем перекрестная реактивность антител, получаегфк по прототипу. | Это говорит о том, что специфичность антител, получаемых пре; лагаемым способом, выше. Поскольку константы ассоциации антител, получаемых предлагаемым способом, вьш1е, чем констан- ты ассоциации антител, получаеьолх по прототипу, то можно утверждать, что сродство антител, получаемых предлагаемым способом, выше. Были получены характеристики связьгаания катехоламина с антигенным носителем, которые сведены в табл. № 2 на примере норадреналина. , В табл. 3 представлены титры антител в полученных антисыворотках. , Из табл. № 3 видно, что титры антител в антисыворотках, полученных предлагаег4ым способом, выше тит-. ров антител в антисыворотках, полу ченных по прототипу. Для сравнения использованы антисыворотки, полученные по прототипу. Таким образом, специфичность целевого продукта возросла в 3-4 раза -по сравнению с известным, что позволяет повысить чувствительность определения сенсибилизации организма к препаратам катехаламина.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К КАТЕХОЛАМИНУ путем иммунизаДии животного антигеном, ковалентно связанным с носителем, с последукяцим забором крови и выделением из нее антисыворотки, отличаю щ и и с я тем, что, с целью повьппения специфичности целевого продукта, в качестве антигена истюльзуют остаток катехоламина, ковалентно связанньй с белком-носителем по следующей формуле Н Н - I - Б . К - ( (снр, N N Н I N где К - остаток катехоламина, содержавший первичную аминогруппу; Н - I Б - остаток антигенного белN ка-носителя . (СН) - алифатическая цепочкаi 2. Способ по п. 1,отличаю(Л щ и и с я тем, что в качестве белканосителя используют сывороточный G: альбумин, бычий тиреоглобулин или гемоцйанин улитки.