СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ БЕЛКОВ Российский патент 2018 года по МПК C07B59/00 B82B3/00 B82Y40/00 C07K1/13 

Область техники

Изобретение относится к изотопно-меченным веществам и может быть использовано для введения радиоактивной метки в белки с целью изучения их использования как радиоактивного индикатора в химических, биохимических и медицинских исследованиях.

Уровень техники

Меченные тритием вещества широко используются при проведении биохимических и фармакокинетических испытаний. Разработано много способов получения меченных тритием низкомолекулярных соединений. Однако набор методов введения трития в белки ограничен.

В работе [Ротт Г.М., Семин Ю.А., Домбровский В.И., Поверенный A.M., Вязов C.O., Дорошенко Н.В. Способ получения меченного белка. SU 968036] описан способ введения трития и углерода-14 в белки с помощью формальдегида, который сначала подвергали взаимодействию с меченной тритием или углеродом-14 аминокислотой. Такой способ позволяет получать модифицированный ³Н-лизином альбумин с удельной радиоактивностью 273 мкКи/мг. При молекулярной массе альбумина 69 кДа удельная активность белка составляет 18 Ки/ммоль или 0,65 атомов трития на молекулу.

В работе [Yu.A. Zolotarev, А.К. Dadayan, Е.V. Bocharov, Yu.A. Borisov, В.V. Vaskovsky, Е.М. Dorokhova, N.F. Myasoedov New development in the tritium labelling of peptides and proteins using solid catalytic isotopic exchange with spillover-tritium // Amino Acids 2003, 24, 325-333. DOI 10.1007/s00726-002-0404-7] описан способ получения пяти- и шестичленных пептидов с помощью твердофазного каталитического замещения протия на тритий и сделан вывод о том, что этим способом может быть достигнута радиоактивность белков 1000 Ки/ммоль (до 34 атомов трития в молекуле белка), хотя примеров получения белков с такой удельной активностью не приводится. Этот подход использовали в работе [Ю.А. Золотарев, А.К. Дадаян, B.C. Козик, Е.В. Гасанов, И.В. Назимов, Р.Х. Зиганшин, Б.В. Васьковский, А.Н. Мурашов, А.Л. Ксенофонтов, О.Н. Харыбин, Е.Н. Николаев, Н.Ф. Мясоедов. Твердофазный изотопный обмен водорода на дейтерий и тритий в генно-инженерном инсулине человека // Биоорг. Хим. 2014, 40, 31-41] для введения трития в инсулин. Получен препарат с удельной радиоактивностью 40 Ки/ммоль, то есть в молекуле белка среднее содержание трития составило 1,4 атома на молекулу.

Повышение удельной радиоактивности низкомолекулярных веществ может быть достигнуто использованием углеродных наноматериалов в качестве подложки. Нанесение 4-(2-аминоэтил)пирокатехола на поверхность наноалмазов способствовало увеличению в 3 раза (с 44 до 135 Ки/ммоль) его удельной радиоактивности при введении трития с помощью каталитического гидрогенолиза в присутствии катализатора Линдлара [Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В., Бадун Г.А., Чернышева М.Г., Федосеев В.М. Равномерно меченный дейтерием или тритием 4-(2-аминоэтил)пирокатехол с использованием наноалмазного порошка. RU 2422436]. Однако условия проведения реакции (нагревание реакционной смеси до 180°С в течение 15 минут) не позволяет использовать данный подход к веществам, которые подвергаются деструкции в этих условиях, в частности, этот подход неприменим ко многим белкам.

Наиболее близким к заявляемому является способ введения тритиевой метки в белки с помощью метода термической активации трития [RU 2499785, 27.11.2013], в котором раствор белка наносили на стенки стеклянного реакционного сосуда и лиофильно высушивали. После чего проводили обработку атомарным тритием, полученным атомизацией молекулярного трития на вольфрамовом катализаторе при температурах атомизатора 1500-2000 К. Показано, что при проведении реакции при температуре мишени 295 К возможно получать меченный тритием альбумин с удельной радиоактивностью 3,32 ТБк/ммоль (89,7 Ки/ммоль), что соответствует введению 3 атомов трития в молекулу белка. Увеличение продолжительности обработки белка атомарным тритием не позволяет существенно увеличить его удельную радиоактивность, но приводит к снижению его радиохимического выхода. Более высокие значения удельной радиоактивности необходимы для повышения чувствительности и нижнего предела обнаружения белка в биохимических исследованиях.

С целью увеличения удельной активности меченых белков предлагается использовать метод термической активации, но предварительно белок наносить на углеродные наноматериалы: наноалмазы детонационного синтеза, углеродные одностенные нанотрубки и оксид графена.

Раскрытие изобретения

Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является разработка способа получения меченных тритием белков с удельной радиоактивностью не менее 1000 Ки/ммоль.

Технический результат настоящего изобретения заключается в повышении удельной радиоактивности меченных тритием белков, получаемых с помощью метода термической активации, с 90 Ки/ммоль до 1000-9000 Ки/ммоль. Предлагаемый метод позволяет получить меченный тритием белок с прочносвязанной меткой за счет того, что связывание трития происходит по связи С-Н.

Указанный технический результат достигается благодаря тому, что для введения трития в белок его наносят не на стеклянную поверхность реакционного сосуда, а предварительно адсорбируют на углеродный материал, который затем размещают на стенках реакционного сосуда. Нанесение белка на углеродные наноматериалы обеспечивает увеличение доступности белка атомам трития при проведении процедуры введения метки, при этом для увеличения доступной для атомов трития поверхности белка используется развитая поверхность углеродных материалов таких как наноалмаз, оксид графена и углеродные нанотрубки.

Поставленная задача решается тем, что способ получения меченных тритием белков с высокой удельной радиоактивностью методом термической активации трития, включает: приготовление водной суспензии углеродных наноматериалов, нанесение на их поверхность белка, равномерное нанесение полученной суспензии на стенки сосуда с последующей лиофилизацией и удалением воздуха, причем упомянутый сосуд содержит установленную с возможностью подключения электрического тока вольфрамовую нить для активации трития, охлаждение дна сосуда, не содержащего мишень, до температуры жидкого азота (77 К), при этом стенки сосуда с нанесенной мишенью поддерживают при температуре 290-298 К, введение газообразного трития и его активацию на вольфрамовой нити в течении 5-15 с. Для введения трития предлагаемым способом можно использовать любые белки, способные адсорбироваться на углеродных материалах из водных растворов, таким образом изобретение можно применить к любым водорастворимым глобулярным белкам.

Осуществление изобретения

Сначала готовится водная суспензия углеродного наноматериала (наноалмаз, оксид графена, одностенные углеродные нанотрубки) с концентрацией 1-2 г/л, например, 5-50 мг углеродного материала суспендируют в 5-50 мл воды. 1-5 мл суспензии переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10-30 минут при скорости от 10000 до 14000 об./мин. Затем отбирают водную фазу и замещают отобранный объем водным раствором глобулярного белка, например, бычьего сывороточного альбумина, с концентрацией 2-5 мг/мл в объемном соотношении от 1÷3 до 3÷1 с обеспечением гомогенности раствора.

Полученную суспензию подвергают ультразвуковой обработке в течении 5±2 мин с помощью ультразвуковой ванны при максимальной мощности для увеличения поверхности сорбции, затем термостатируют при 20-25°С в течении 12-24 часов до достижения равновесной адсорбции альбумина. После термостатирования суспензию центрифугируют в течении времени достаточного для осаждения наноматериалов. В среднем указанное время составляет 10-20 минут. Определяют равновесное количество белка в растворе при помощи окрашивания Coomassie G250. Количество адсорбированного белка на поверхности углеродного материала определяют по уменьшению его концентрации в растворе. Затем отбирают раствор над наноматериалом и промывают осадок водой от несвязанного белка. Удаление свободного несвязавшегося белка от наноматериала проводят центрифугированием с отделением надосадочного раствора и добавкой новой порции воды в объеме не менее исходного объема промываемой суспензии; процедура отмывки повторяется 4-5 раз для уменьшения концентрации свободного белка не менее чем в 1000 раз от исходной. Таким образом получают суспензию наноматериала, на которую нанесен мономолекулярный слой белка.

После этого полученную суспензию в количестве от 0,001 до 0,01 мг/см² вносят в сосуд для работы с газообразным тритием, описанный в работе [И.А. Разживина, Г.А. Бадун, М.Г. Чернышева, В.И. Коробков, А.Е. Жирнов. Полимерные пленки как индикатор спилловера водорода через газовую фазу. Радиохимия. 2017. Т. 59, N 3, С. 248-254], раскатывают по стенкам, полностью замораживают жидким азотом и высушивают с помощью лиофилизации. Сосуд с нанесенным веществом присоединяют к вакуумной установке для работы с газообразным тритием, заполняют сосуд газообразным тритием или смесью трития с водородом до давления 1,3±0,5 Па. Дно сосуда охлаждали до температуры 77-78 К, для обеспечения вымораживания побочных продуктов (аммиак, углекислый газ, вода). Для замораживания может быть использован жидкий азот. Нагревают вольфрамовый катализатор до 1750-1950 К помощью электрического тока в течении 5-20 с. После реакции систему вакуумируют, сосуд с облученной мишенью заполняют воздухом и снимают с установки. Для удаления трития из лабильных положений суспензию упаривают на роторном испарителе, твердую фазу ресуспензируют в воде.

Продолжительность нагревания вольфрамового катализатора в течение 5-20 с обеспечивает оптимальные условия по введению трития в белки: при более короткой экспозиции не успевает установиться стационарный режим атомизации, за 20 с проходит активация всего трития.

Для определения удельной радиоактивности белка с помощью аминокислотного анализа по стандартной методике Спэкмена, Штейна и Мура [Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. // Anal. Chem. 1958. V. 30. 1185-1190] твердую фазу суспендируют в гидролизной смеси, содержащей смесь соляной и трифторуксусной кислот в соотношении объемов 2:1 с 0,001% добавкой β-меркаптоэтанола. Суспензию переносили в стеклянные ампулы, замораживали жидким азотом, откачивали воздух и запаивали. Для получения гидролизата белка ампулы помещают в печь, прогретую до 155±5°С и оставляют на 60±5 минут. По окончании гидролиза ампулы охлаждают до комнатной температуры, раствор над наноматериалом отбирают и упаривают с помощью лиофилизации. Остаток растворяют в 0,1 М соляной кислоте и проводят аминокислотный анализ. Радиоактивность белка рассчитывают как сумму радиоактивностей аминокислотных остатков. Найденная радиоактивность относится к тритию, прочно связанному в белке по связям С-Н, так как легко обменный тритий был удален в результате процедур обработки: сначала обменом в воде при комнатной температуре, затем при гидролизе белка в кислой среде при 155±5°С; после проведения такой обработки раствор упаривали досуха для удаления трития, перешедшего из белка в воду.

Используемые наноматериалы должны иметь удельную поверхность не менее 200 м²/г, размер отдельных частиц наноматериалов может быть любой.

Соотношение объемов растворов суспензии наноматериалов и белка, а также их концентрации выбирают из условия возможности покрытия материалов мономолекулярным слоем белка.

Способ позволяет получить меченный тритием белок с прочносвязанной меткой за счет того, что связывание трития происходит по связи С-Н, это подтверждается результатами аминокислотного анализа.

Реализация предложенного изобретения описана в Примерах.

Пример 1. Получение суспензии наноматериала с адсорбированным альбумином.

Водную суспензию углеродного наноматериала (наноалмаз, оксид графена, одностенные углеродные нанотрубки), содержащую 1 мг твердой фазы осаждали с помощью центрифугирования, отбирали водную фазу и добавляли 1 мл раствора бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 2,5 мг/мл. Суспензии подвергали ультразвуковой обработке в течении 10 мин с помощью ультразвуковой ванны при максимальной мощности и термостатировали в течении суток при 25°С. Суспензии центрифугировали и определяли равновесное количество белка в растворе при помощи окрашивания Coomassie G250. Количество адсорбированного альбумина на поверхности углеродного материала определяли по уменьшению концентрации в растворе. Отбирали раствор над наноматериалом, промывали осадок водой от несвязанного белка, для чего проводили добавку новой порции воды, центрифугировали в течение 10 минут, отделяли надосадочный раствор и повторяли эту процедуру 4 раза.

Пример 2. 1 мг наноалмаза с нанесенным альбумином, полученного способом по примеру 1, суспендировали в 1 мл воды и наносили на стенки реакционного сосуда для работы с газообразным тритием, замораживали жидким азотом и высушивали с помощью лиофилизации. Сосуд с нанесенным веществом присоединяли к вакуумной установке для работы с газообразным тритием, заполняли сосуд газообразной тритий-протиевой смесью (содержание трития 31%) до давления 1,3 Па. Дно сосуда охлаждали жидким азотом. Нагревали вольфрамовый катализатор до 1800±30 К помощью электрического тока в течении 10 с. После реакции систему вакуумировали, сосуд с облученной мишенью заполняли воздухом и снимали с установки. Для удаления трития из лабильных положений суспензию упаривали на роторном испарителе, твердую фазу ресуспензировали в воде и повторяли процедуру упаривания. Твердую фазу суспендировали в гидролизной смеси, содержащей смесь соляной и трифторуксусной кислот в соотношении 2:1 с 0,001% добавкой β-меркаптоэтанола. Суспензию переносили в стеклянную ампулу, замораживали жидким азотом, откачивали воздух и запаивали. Ампулы помещали в печь, прогретую до 155°С и оставляли на 1 час. По окончании гидролиза ампулы охлаждали при комнатной температуре, вскрывали, раствор над наноалмазами отбирали и упаривали с помощью лиофилизации. Осадок растворяли в 0,1 М соляной кислоте, исследовали на аминокислотном анализаторе Amino Acid Analyzer Hitachi L-800 (Япония) по стандартной методике Спэкмена, Штейна и Мура [Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. // Anal. Chem. 1958. V. 30. 1185-1190.]. Данные, полученные с аминокислотного анализатора и проточного счетчика (оптическое поглощение элюата по реакции с нингидрином при длинах волн 570 и 440 нм и радиоактивность элюата), обрабатывали при помощи программы «МультиХром для Windows». Радиоактивность белка, рассчитанная как сумма радиоактивностей аминокислотных остатков, составила 2,7×10³ Ки/ммоль (в пересчете на 100% содержание трития в тритий-протиевой смеси, составила 8,7×10³ Ки/ммоль или 300 атомов трития в молекуле белка).

Пример 3. 1 мг углеродных нанотрубок с нанесенным альбумином, полученного способом аналогичным примеру 1, суспендировали в 1 мл воды и наносили на стенки реакционного сосуда для работы с газообразным тритием, замораживали жидким азотом и высушивали с помощью лиофилизации. Введение метки проводили по методике, описанной в примере 1. Радиоактивность белка, рассчитанная как сумма радиоактивностей аминокислотных остатков, составила 1,6×10³ Ки/ммоль (в пересчете на 100% содержание трития в тритий-протиевой смеси, составила 5,2×10³ Ки/ммоль или 300 атомов трития в молекуле белка).

Пример 4. 1 мг углеродных оксида графена с нанесенным альбумином, полученного способом аналогичным примеру 1, суспендировали в 1 мл воды и наносили на стенки реакционного сосуда для работы с газообразным тритием, замораживали жидким азотом и высушивали с помощью лиофилизации. Введение метки проводили по методике, описанной в примере 1. Радиоактивность белка, рассчитанная как сумма радиоактивностей аминокислотных остатков, составила 1,6×10³ Ки/ммоль (в пересчете на 100% содержание трития в тритий-протиевой смеси, составила 5,2×10³ Ки/ммоль или 300 атомов трития в молекуле белка).

Изобретение относится к способу получения изотопно-меченых веществ и может быть использовано для введения радиоактивной метки в белки с целью изучения их поведения в различных системах, включая биологические. Описан способ получения меченных тритием белков при использовании в качестве метящего агента атомарного трития, получаемого при термической каталитической диссоциации молекул трития на вольфрамовой проволоке. Принципиальное отличие предлагаемого способа от ранее описанных заключается в том, что предварительно белок наносят на углеродные наноматериалы, а затем обрабатывают атомарным тритием. При проведении реакции с атомарным тритием температура стенок реакционного сосуда поддерживается в интервале 291-298 K, при охлаждении до 77 K только нижней части сосуда, на которой нет вещества. Способ позволяет получить меченные тритием белки с увеличенной удельной радиоактивностью до 9000 Ки/моль. 3 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Способ получения меченных тритием водорастворимых глобулярных белков, включающий:

- приготовление водной суспензии углеродного наноматериала с концентрацией 1-2 г/л;

- приготовление водного раствора белка с концентрацией 2-5 г/л;

- смешение водной суспензии наноматериала с водным раствором белка в объемном соотношении от 1÷3 до 3÷1 с обеспечением гомогенности раствора;

- выдерживание полученной суспензии не менее 12 часов до достижения равновесной адсорбции белка на наноматериале;

- удаление свободного несвязавшегося белка из смеси центрифугированием;

- нанесение полученной суспензии на стенки сосуда, содержащего вольфрамовую нить, в количестве от 0,001 до 0,01 мг/см² с последующей лиофильной сушкой до образования пленки;

- заполнение сосуда газообразным тритием или смесью трития с водородом;

- активацию трития посредством нагрева вольфрамовой нити до температуры 1750-1950 K в течение 5-20 с с одновременным охлаждением дна сосуда до температуры жидкого азота с получением пленки, содержащей меченные тритием белки, и последующим ресуспендированием пленки в воде и извлечением из сосуда полученной суспензии.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве углеродного наноматериала используют наноалмаз, оксид графена, одностенные углеродные нанотрубки с удельной наноповерхностью не менее 200 м²/г.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что центрифугирование для удаления свободного несвязавшегося белка повторяют 4-5 раз с добавлением новой порции воды не менее объема суспензии.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что нанесение суспензии на стенки сосуда реализуют раскатыванием по стенкам, обеспечивающим возможность равномерного распределения наноматериала с белком на его стенках.