Способ определения концентрации микроорганизмов Советский патент 1982 года по МПК C12N1/00 C12Q1/06 

1

Изобретение относится к микробиологии, , в частности к способам определения концентрации микроорганизмов.

Известен способ определения концентрации микроорганизмов, включающий регистрацию хемилюминесценции, возникающей при разложении перекиси водорода ферментом каталаза в присутствии хемилюминесцентного состава 1 .

Недостатком способа является его огра- ничейная применимость, так как не все микроорганизмы содержат каталазу.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения концентрации микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов в водной среде, окисление клеточных структур марганцевокислым калием и регистрацию кинетики хемилюминесценции. Согласно этому способу к анализируемой суспензии микроорганизмов в дистиллированной воде добавляют раствор марганцевокислого калия. При окислении марганцевокислым калием белков

клеточных оболочек бактерий возникает хе милюминесценция, по кинетике которой можно различать живые и мертвые бактерии. Для мертвых микроорганизмов с момента введения окислителя интенсивность хемилюминесценции во время растет, достигает максимального значения и относительно медленно уменьшается. Для живых микроорганизмов интенсивность хемилюминесценции возрастает, проходит через максималь10ное значение, уменьшается, затем снова возрастает, проходит через второе максимальное значение и далее снова уменьшается. На фиг. 1 представлены кинетические хемилюминесцентные кривые живых и Mejrr вых микроорганизмов Candida guillermonolii суспендированных в дистиллированной воде. Окислитель 0,1% + 1,8 М BaCIj. Концентрация Candida guillermondii ./ /проба. Стрелкой обозначено время ввода

20 окислителя. Кривая 1 - Candida guillermon- dii, убитые кипячением, кривая 2 - суспензия, содержащая 98% живых клеток. По оси ординат интенсивность хемилюминесцен39ции, отн. ед., масштаб кривой 1- составляет 1:10 от масштаба 2, по оси абсцисс время, с. Интенсивность хемилюминесценции в обоих случаях прямо пропорциональна концентратдаи микроорганизмов. Для суспензий, содержаших одновременна, живые и мертвые бактерии, интенсивность первого максимума 0 меньше, чем для мертвых бактерий и выше, чем для живых, а интенсивность второго максимума 3q мень ше, чем для живых. Отношение интенсив, ностей J у Л уменьшается с уменьшением от носительного содержания живых бактерий, т.е. величина 2 / характеризует относительное содержание бактерий в анализируемой суспензии, а значения J и 3 rj - концентрацию микроорганизмов 2. Недостатком способа является небольшая точность oпpeдeлeHkя концентрации и относительного содержания живых микроорга низмов, связанные с невысокой чувствительностью способа для живых бактерий по сравнению с мертвыми, вследствие дестабили зации мембранных белков живых клеток в дистиллированной воде. Величина интенсивное ти второго максимума на кинетической кривой хемилюминесценции, зарегистрированной для живых микроорганизмов (фиг. 1, кривая 2), незначительно превышает величину интенсивности на кривой хемилюминесценции мертвых микроорганизмов при времени, соответствующем второму макси1иуму хемилюмииесценции живьгх бактерий. Вследствие этого в диапазоне относительного содержания живых микроорганизмов рт О до 50% концентрацию живых микроорганизмов практически невозможно определить. Целью изобретения является повышение точности определения концентрации клеток и относительного содержания живых микроорганизмов. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации микроорганизмов, предусматривающему приготовление суспензии микроорганизмов в водной среде, окисление клеточных структур марганцевокислым калием И регистрацию кинетики хемилюминесценции, перед окислением клеточных структур добавляют в водную среду днгидрофосфат калия до достижения рН 4.0-4,7 и выдерживать в течение 2-10 мин. Способ основан на стабилизации клеточных оболочек живых Микроорганизмов иона ми водорода и на смещении равновесия между окислительными состояниями марганца в сторону ионов трехвалентного марганца при помощи ионов водорода и фосфата. В результате взаимодействия мембран и кле ТОЧНЫХ оболочек живых клеток с ионами водорода, образующимися при диссо1шации дигидрофосфата калия, структурные единицы мембран увеличивают устойчивость. При взаимодействии марганцевокислого калия с живыми клетками второй максимум хемилюминесценции обусловлен реакцией ионов марганца с реактивными белковыми группами, экспонированными внутрь клетки. Доступность реактивных групп зависит от скорости Проникновения ионов марганца в клетку и от скорости разрушения оболочек клеток окислителем, происходящего одновременно с хемилюминесцентной реакцией. При стабилизации мембранных белков скорость разрушения клеточной оболочки марганцевокисдым калием уменьшается, а количество неразрушенных клеток увеличивается. В результате зтого к моменту появления второго максимума количество реагирующих с ионами марганца белковых групп больше, чем в случае нестабилизированных мембран, что и приводит к увеличению интенсивности второго максимума хемилюминесцентной кинетической кривой. Введение дигидрофосфата калия в контакт ft марганцевокислым калием препятствует образованию двуокиси марганца, образующейся в нейтральной среде и вьшодягцей ионы марганца из реакции. Вследствие этого увеличивается степень превращения перманганат-аниона в ионы трехвалентного марганца, участвующие в процессе излучения энергии. Увеличение концентрации ионов Мп вызывает увеличение скорости реакции окисления и, соответственно, скорости спада интенсивности хемилюминесценции мертвых микроорганизмов, что обеспечивает уменьшение отношения Для мертвых бактерий по сравнению с нейтральной средой и увеличение различия значений II г /3 живых и мертвых микроорганизмов. На фиг. 2 представлены зависимости интенсивности второго максимума хемилюминесценции 32 (кривая 1), отношения интенсивностсй второго и первого максимумов Зг2 /И-) (кривая 2) суспензии MicrococCUS glutamicus и интенсивности фонового свечения среды ннкубагщи J ф (кривая 3) от рН. Кислотность среды варьируют введением дигидрофосфата калия различной концентрации. Концентрация Micrococcus I -10 кл./ /проба (95% живых клеток), время инкубации 10 мин. Условия окисления те же, что и на фиг. 1. По оси ординат J,, и Зф в относительных единицах, по оси абсцисс рН среды инкубации. Интенсивность D при рН 7 принята за единицу. Из данных фиг. 2, видно, что введение дигидрофосфата калия до рН 4,7-4,0 в суспензию микроорганизмов приводит к увеличению интенсивности второго максимума хемилюминесденции 3 2 и отношения 3 „ /3 . Дальнейшее уменьшение рН, помимо увеличения интенсивности Л „ и отношения приводит к резкому возрастанию интенсивности фонового свечения среды инкубации Л d) (кривая 3 на фиг. 2), что увеличива, ет погрешность определения величин 3 к Ч I -1 -В -таком случае оптимальными зна чениями рН среды инкубации являются 4,7- 4,0, при которых способ позволяет определять концентрацию микроорганизмов в диапазоне относительного содержания живых клеток от 20 до 100%. Время прединкубации суспензии микроорганизмов с дигидрофосфатом калия должно составлять не менее 2 мин, поскольку, на чиная с этого момента, отношение интенсивностей Dn /3 становится максимальным и не меняется при увеличении времени прединкубации. На фиг. 3 представлена зависимость отношения интеисивностей второго и первого максимума хемилюминесцентной кинетической кривой . суспензии Micrococcus glutom cus от времени инкубации с 0,05 М дигидро фосфатом калия (рН 4,63). Концентрация Micrococcus 1 -10 кл./проба (95% живых клеток). Условия окисления те же, что на фиг. 1. По оси ординат 3 /J, по оси абс-цисс время инкубации, мин. Способ осушествляют следуюшим образо К 0,5 мл суспензии Candida guillermondii добавляют 0,5 мл 0,1 М дигидрюфосфата калия (рН смеси 4,63) и выдерживают 2 мин при комнатной температуре. Отбирают 0,2 мл в кварцевую кювету и помешают в кюветное отделение установки для регистрации кинетики хемилюминесцеН1щи. Вводят в кювету 0,2 мл раствора окислителя (0,1% КМпО4 + + 1,8 М BaClj) и одновременно начинают регистрировать кинетику хемилюминесцентной реакш и. После проведения реакции по хемил минесцентной кинетической кривой определяю значения интенсивностей первого и второго максимумов ( Э и D соответственно). Концентрацию живых микроорганизмов определяют по эмпирической формуле С - к(Э2- А:),(1) где С - концентрация живых микроорганизА - значение отношения интенсивностей второго и первого максимумов хемилюминесценции 3i J-I определенное для Candida guillernrandii, убитых кипячением (поскольку второй максимум на кинетической кривой мертвых клеток отсутствует; в качестве JQ используется значение интенсивности хемилюминесценции при времени второго максимума живых клеток. К определяется по калибровочной кривой, описывающей интенсивности суспензий с известной концентрацией живых клеток. Относительное содержание живых клеток (х) определяют путем расчета отношения зарегистрированных интенсивностей второго и первбго максимумов хемилюминесцеиции ho эмпирической формуле следующего вида 5/:,-я ,-р7- де А - определяется так же, как и в формуле (1);. В, D - постоянные, рассчитанные экспериментально из опытов с использованием суспензий с известным относительным содержанием живых клеток после преобразования формулы (2) в линейное уравнение (3„/3, - А) 100 /1 , (3) подставляя в уравнение (3) значения Эп/Э для toyx суспензий с разным известным относительным содержанием живых клеток, определяют значения В и D. Для суспензии Candida guillermondif при рИ 4,63 значения А, В и D.составляют 0,068, 0,0064 и 0,993 соответственно. Сравнивают результаты по измерению концентрации и относительного содержания живых клеток в суспензии Candida guillermondii известным и предлагаемым способами. Контроль концентрации живых микроорганизмов осуществляют путем высова пробы на чашки Петри с питательной средой и подсчета выросших колоний. Относительное содержание живых микроорганизмов измеряют путем подсчета общей концентрации клеток в камере Горяева с последующим делением числа жизнеспособных клеток на их общее количество. Результаты экспериментов приведены в таблице. Как видно из таблицы, при относительном содержании живых клеток менее 50%, когда известный способ не позволяет точно определять концентрацию и относительное содержание живых микроорганизмов, введение в водную срюду дигидрофосфата калия обеспечивает определение относительного содержания живых клеток с точностью до 4%, а концентрации живых клеток с точностью до 10%. При относительном содержании живых

микроорганизмов свыше 50% предлагаемый спо-5 Ьтносительного содержания от 20 до 100% с соб дает точность для относнтгельного содержа- (точйостью определения относительного содержаНИЛ в 1,5 раза выше, чем известный способ, для концентрации живых микроорганизмов точность в 2,5 раза выше.

Таким образом, использование предлагаемого процессов биосинтеза, анализе готового

способа определения концентрации микроорга9736108

ниэмов по сравнению с известными способами позволяет в одном эксперименте одновременно определять концентрацию и относительное содер санке живых микроорганизмов в диапазоне ния в диапазоне от 20 до 70% не выше 4%, а в диапазоне от 70 до 100 не выше 1%, что

особенно важно при контроле производственпродукта и стандартизации музейных культур.

Формула изобретения Способ определения концентрацин микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов В водной среде, окисление клеточных структур марган оневокислым калием и регистрацию кинетики хемилюминесценцик, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения концентрации клеток и относительного содержания живых микроорганйймов, перед окислением клеточных структур

в водную среду вводят дигидрофосфат калия до достижения рН 4,0-4,7 и выдерживают в течение 2-10 мин.

Источники информации, , принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 473744, кл. С 23 Q 1/06, 1973.

. 2. Лебедев В, С. Исследование структурных переходов в оболочке бактерий Е. СоП хемилюминесцентным методом. Канд. дисс. М., 1977.

Фч-1.2

1 1J |Г t 10 Фт.З