ЭКСПРЕССНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ, БАКТЕРИЙ И ДРОЖЖЕЙ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/04 G01N33/48 

Изобретение относится к способу экспрессного определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в пробах разной консистенции и может быть использовано в медицине, формации, пищевой и легкой промышленности, в сельском хозяйстве, нефтедобывающей промышленности и при защите сырья, материалов и изделий из них от микроорганизмов.

Известен способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей путем высева анализируемых проб на селективные питательные среды в чашки Петри, термостатирования в течение 24-72 часов при температуре (25-37)±1°C. О принадлежности микроорганизмов к данной группе судят по характеру роста на конкретной среде и по виду колоний. Способ весьма трудоемок и продолжителен во времени. (Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология, "ГЭОТАР медицина", М., 1999. - 1183 с.)

Известен быстрый (15-30 мин) способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей, основанный на методах окраски с последующим микроскопированием (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований, "Медицина", М., 1978. - 391 с.). Способ включает следующие операции: приготовление фиксированного мазка исследуемого образца, окрашивание препарата, промывание водопроводной водой, подсушивание и микроскопирование с иммерсионной системой. О принадлежности микроорганизмов к бактериям, грибам или дрожжам судят по морфологическим особенностям окрашенного препарата.

Недостатком этого способа является большая трудоемкость, обязательное использование спецлаборатории, дорогостоящих приборов, посуды, оборудования и недостаточная чувствительность.

Техническая задача, на решение которой направлен заявленный экспрессный способ, являлось определение микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в пробах разной консистенции, при контроле повреждений микроорганизмами сырья, материалов и изделий из них, снижение трудоемкости, исключение использования спецлаборатории, спецоборудования и приборов, снижение числа используемой посуды, реактивов, повышение чувствительности.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе, включающем:

1. Растворение исследуемой пробы в стерильном физрастворе.

2. Помещение реактива (0,1-0,8%-ного раствора люминола в щелочи (рН 10,0-13,8), к 100 см³ которого добавляют 0,3-1,0 см³ 30%-ной перекиси водорода) в кювету для анализа.

3. Смешение реактива с растворенной пробой в реакционной камере прибора.

4. Контроль параметров кинетики протекающей люминольной реакции.

Вышеперечисленные действия анализа проводят с помощью анализатора жидких проб (Патент №2009466 от 15.03.1994 г., G 01 N 15/02), сертифицированного как анализатор жидкостей хемилюминесцентных ЛИК (сертификат РФ №14433 от 27.03.03, Госреестр РФ №24512-03 от 12.03.03.)

Известно (Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, М.: Ин. лит-ра, 1966. - 728 с.), что абсолютное большинство микробов содержат в своих биохимических системах ферменты группы оксидаз. Эти ферменты ответственны за окислительно-восстановительные процессы, в составе которых имеется железопорфирины.

При смешивании анализируемой пробы, содержащей микробные клетки, с раствором люминола они денатурируют и оксидазные ферменты катализируют распад перекиси водорода по цепному свободно радикальному процессу. Возникает перенос электрона (гомолиз)

Fe²⁺+Н₂O₂→Fe³⁺+ОН^-+ОН^*

И последующие реакции

В процессе последних реакций рекомбинации свободных радикалов образуются короткоживущие соединения типа ассоциированного и неассоциированного Ван-дер-Ваальсовского комплексов кислорода, обладающие избыточной энергией, которая трансформируется люминолом в световую по реакции:

Таким образом, люминол выступает в роли трансформатора избыточной энергии комплексов кислорода в световую, а перекись водорода выступает в качестве их источника при ее катализе ферментами группы оксидаз.

Для регистрации квантов света используют анализатор жидкостей ЛИК, технические характеристики которого позволяют регистрировать кинетику хемилюминесценции, производить расчет ее параметров, по совокупности которых проводят определение либо микроскопических грибов, бактерий или дрожжей.

На фиг.1 представлена кинетическая кривая хемилюминесценции и ее регистрируемые параметры, где по оси абсцисс отложено t - время, сек; по оси ординат I_хл - интенсивность хемилюминесценции, отн.ед. (1 отн.ед=1,6375×10^-11 Лм, люмен); A_m - максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, отн.ед.; t_m - время достижения интенсивности хемилюминесценции своего максимального значения, сек; S - площадь под кривой кинетики хемилюминесценции, отн.ед.×с.

На фиг 2-4 представлены кинетические кривые хемилюминесценции, получаемые от грибов, бактерий и дрожжей:

фиг.2 - форма кривой кинетики, инициируемая микроскопическими грибами;

фиг.3 - форма кривой кинетики, инициируемая дрожжами;

фиг.4 - форма кривой кинетики, инициируемая бактериями.

В таблице 1 приведены конкретные значения контролируемых параметров кинетики хемилюминесценции при анализе проб, содержащих вышеуказанные микроорганизмы.

Пример: проводили анализ смывов с поверхностей оборудования, которое эксплуатировалось на колбасном заводе, хлебозаводе, продовольственном магазине (поверхности корпуса и лопастей смесителей, поверхности холодильных установок, столов расфасовки и обеденных столов). Смыв осуществляли стерильным физиологическим раствором с соблюдением мер стерильности и проводили анализ смывной жидкости на приборе ЛИК.

Перед проведением анализа отобранных проб готовили разведения чистых культур микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в стерильном физрастворе концентрацией 10⁵-10⁶ клеток/см³. Концентрацию клеток в разведении контролировали с помощью прибора мутности. В качестве чистых культур использовали Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium glaucum. Готовили прибор ЛИК к работе согласно инструкции.

Полученные разведения чистых культур поочередно анализировали на приборе ЛИК, регистрируя при этом значения максимальной интенсивности хемилюминесценции, время достижения хемилюминесценции своего максимального значения и площадь под кривой хемилюминесценции. Каждый анализ культуры проводили десять раз, вычисляли среднее значение контролируемых параметров и запоминали в памяти компьютера. Полученные значения контролируемых параметров кинетики хемилюминесценции чистых культур в последующем использовали как контрольные при анализе проб, отобранных с поверхностей различных объектов.

Для этого в кювету прибора наливали 0,5 см³ анализируемой пробы и помещали ее в реакционную камеру. Камеру закрывали крышкой-дозатором, в полость которого наливали 0,5 см³ хемилюминесцентного состава. Закрывали крышку прибора, нажимали на кнопку, "Пуск", а затем на крышку прибора. При этом хемилюминесцентный состав из полости крышки-дозатора через калиброванное отверстие вводился в кювету с пробой. При наличии в ней микробных клеток реакционная смесь начинает светиться. Свет преобразуется в электрический сигнал, который обрабатывается по специальному алгоритму и отображается на экране компьютера в виде кривой кинетики, и автоматически компьютер рассчитывает контролируемые ее параметры. Рассчитанные параметры анализируемой пробы сравниваются с представленными в таблице 1 и таким образом определяют наличие в анализируемой пробе микроскопических грибов, бактерий или дрожжей.

Хемилюминесцентный состав готовят путем смешения 100 см³ 0,1-0,8%-ного раствора люминола в щелочи (рН 10,0-13,8) с 0,3-1,0 см³ 30%-ной перекиси водорода.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что предлагаемый способ позволяет проводить экспрессное определение в пробах разной консистенции микроскопических грибов, бактерий и дрожжей, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблицах 2-4.

Использование предлагаемого экспрессного способа имеет следующие преимущества:

- нет надобности в сложной подготовке проб к анализу;

- для определения в анализируемых пробах микроскопических грибов, бактерий и дрожжей используется хемилюминесцентный состав и прибор отечественного производства с чувствительностью 30-70 КОЕ/см³, а сама кривая кинетики хемилюминесценции отображается в процессе анализа на мониторе компьютера, что позволяет оператору исключить ошибки при проведении анализа;

- определение в пробах микроскопических грибов, бактерий и дрожжей по параметрам кривой кинетики хемилюминесценции проводится впервые в микробиологической практике, которые прямо связаны с морфологией и особенностями биохимических систем их клеток, содержащих ферменты группы оксидаз;

- быстрота (100 с) получения аналитического эффекта и отсутствие последствия;

- впервые обеспечена возможность быстро проводить определение указанных микроорганизмов непосредственно на объектах контроля, в том числе и на открытой местности;

- исключены посев проб на селективные питательные среды, их термостатирование и микроскопирование.

Таблица 1
Контролируемые параметры кинетики хемилюминесценции при анализе пробМикроорганизмыА_m, отн.ед.t_m, сек.S, отн.едМикроскопические грибы5,5±4,5·10⁶0,2±0,110,3±9,7·10⁸Бактерии4,3±4,2·10⁷4,5±2,57,8±7,47·10⁹Дрожжи2,1±2,0·10⁷1,15±1,123,28±3,22·10⁸Таблица 2
Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах колбасного заводаКонтролируемый объектA_m, отн.ед.t_m, секS, отн.едВывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжейКонтрольные пробыФизиологический раствор4,6·10⁵0,042,7·10⁶нетEscherichia coli1,3·10⁶6,391,6·10⁷бактерииSaccharomyces cerevisiae1,6·10⁶2,224,6·10⁷дрожжиPenicillium glaucum1,2·10⁶0,211,4·10⁷грибыПробы с объектовРазделочный стол6,6·10⁵0,052,3·10⁶нетПол4,4·10⁶0,244,3·10⁷грибыБак с отходами2,6·10⁶6,507,8·10⁷бактерииОбеденный стол1,2·10⁶6,391,6·10⁷бактерии

Таблица 3
Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах хлебозаводаКонтролируемый объектA_m, отн.ед.t_m, секS, отн.едВывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжейКонтрольные пробыФизиологический раствор4,6·10⁵0,042,7·10⁶нетEscherichia coli1,3·10⁶6,391,6·10⁷бактерииSaccharomyces cerevisiae1,6·10⁶2,224,6·10⁷дрожжиPenicillium glaucum1,2·10⁶0,211,4·10⁷грибыПробы с объектовЛопасти смесителя4,2·10⁶0,605,4·10⁷дрожжиПоверхность корпуса1,0·10⁷2,122,2·10⁸дрожжиПол в раздевалке2,4·10⁶0,122,3·10⁷грибыТаблица 4
Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах продовольственного магазинаКонтролируемый объектAm, отн.едtm, секS, отн.едВывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжейКонтрольные пробыФизиологический раствор5,3·10⁵0,043,1·10⁶нетEscherichia coli1,1·10⁶6,823,2·10⁷бактерииSaccharomyces cerevisiae2,4·10⁶1,903,8·10⁷дрожжиPenicillium glaucum6,9·10⁶0,155,7·10⁷грибыПробы с объектовСтены2,1·10⁶7,027,9·10⁷бактерииПол1,4·10⁷0,121,5·10⁸грибыСтол для резки3,6·10⁵0,041,8·10⁶нет

Изобретение относится к биотехнологии, касается определения микроскопических грибов, бактерий или дрожжей в анализируемой пробе и может быть использовано в медицине, фармацее, пищевой и легкой промышленностях. Изобретение предусматривает использование хемилюминесцентного состава, включающего в себя щелочной раствор люминола, к которому добавляют перекись водорода. Определения присутствия микроскопических грибов, бактерий и дрожжей осуществляют на сертифицированном анализаторе жидкостей хемилюминесцентном ЛИК путем смешения пробы с хемилюминесцентным составом в его реакционной камере с последующей регистрацией кривой кинетики хемилюминесценции, по расчетным параметрам которой определяют принадлежность микроорганизма к бактериям, грибам или дрожжам. Преимуществом предложенного способа являются: отсутствие термостатирования, быстрота (100 с) получения результата, достоверность и точность результатов, а также возможность идентифицировать бактерии, дрожжи, микроскопические грибы. 4 ил., 4 табл.

Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в анализируемой пробе, отличающийся тем, что пробу смешивают с реактивом, включающим в себя 0,1-0,8%-ный раствор люминола в щелочи с рН 9,0-13,0 в 100 см³ которого добавляют 0,3-1,0 см³ 30%-ной перекиси водорода в кювете анализатора жидкостей хемилюминесцентного ЛИК, регистрируют параметры хемилюминесценции: максимальную ее интенсивность (А_m), время достижения максимума хемилюминесценции (t_m) и площадь по кривой хемилюминесценции (S), по совокупности значений которых устанавливают наличие в пробе микроскопических грибов, бактерий и дрожжей.