Соль-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина, обладающая антиоксидантной активностью, и способ ее получения Российский патент 2024 года по МПК C07D213/65 A61K31/44 A61P39/06 

Изобретение относится к новому соединению - а именно к соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I:

обладающей антиоксидантной активностью, а также к способу получения соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I и может найти применение в различных областях медицины для коррекции метаболических и сердечно-сосудистых нарушений под влиянием окислительного стресса.

У человека окислительный стресс (ОС) является причиной или важной составляющей многих серьезных заболеваний. Окислительный стресс возникает при чрезмерной продукции свободных радикалов в результате недостаточного функционирования противодействующей антиоксидантной системы.

Следует отметить, что в результате техногенных преобразований окружающей среды (загрязнение атмосферы выхлопными газами и пестицидами, наличие в воде и продуктах питания токсичных веществ) возникают предпосылки для активизации процессов образования свободных радикалов. В связи с этим поиск и разработка способов коррекции ОС является крайне актуальной проблемой современной медицины. Один из главных способов коррекции ОС - применение веществ, обладающих широким спектром антиокислительного действия (антиоксидантов). Российское правительство разработало «План мероприятий по импортозамещению в фармацевтической промышленности Российской Федерации до 2024 года», поэтому создание отечественных лекарственных средств, в том числе антиоксидантов, приобретает особую важность.

2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин (ЭМГП) в виде солей с органическими кислотами достаточно широко используется в медицине. Известным препаратом является мексикор (сукцинат ЭМГП, проявляющий кардиопротекторные и антиокислительные свойства (А.П. Голиков, Б.В. Давыдов и др. Влияние мексикора на окислительный стресс при остром инфаркте миокарда. Кардиология, 2005, 45(7), с. 21-26; RU 2299730, 27.05.2007; RU 2304964, 27.08.2007). N-ацетилцистеинат ЭМГП характеризуется антиоксидантным и гипогликемическим действием (RU 2357955, 10.06.2009). Антигипоксической активностью обладают ацетилсалицилат (RU 2442774, 20.02.2012) и салицилат ЭМГП (RU 2652891, 03.05.2018). Соли ЭМГП с фумаровой кислотой (RU 2365582, 27.08.2009) и никотиновой кислотой (RU 2454406, 27.06.2012) применяются для коррекции метаболизма при сахарном диабете. Известны соли ЭМГП с органическими дикарбоновыми кислотами, обладающие антиоксидантной и анксиолитической активностью (RU 2284993, 10.10.2006).

Недостатком препаратов ЭМГП в виде солей с органическими кислотами является высокая кислотность, что может приводить как к местному повреждению тканей желудочно-кишечного тракта, так и к общему нарушению кислотно-щелочного баланса.

L-карнитин - природное вещество, представляет собой четвертичное аммонийное соединение (внутреннюю соль тетра-алкил аммония), участвующее в метаболизме большинства млекопитающих, растений и некоторых бактерий. Основными источниками энергии у живых организмов наряду с углеводами являются жиры. Образование энергии из жиров зависит от согласованной работы множества ферментов и переносчиков. Конечной и одной из важнейших стадий этого процесса является окисление жирных кислот и синтез АТФ в митохондриях. Уровень синтеза АТФ зависит от поступления жирных кислот внутрь митохондрий. Ключевым участником этого процесса является L-карнитин, который транспортирует длинноцепочечные жирные кислоты в митохондрии. Кроме того, карнитин участвует в удалении продуктов метаболизма из клеток (Fritz I., McEwen В. Effects of carnitine on fatty acid oxidation by muscle. Science. - 1959. Vol. 129. P. 334-335).

Наиболее близким к предлагаемому новому соединению по химической структуре и свойствам является препарат мексидол (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат) формулы II:

Мексидол является антиоксидантом, оказывающим антигипоксическое, мембранопротекторное и анксиолитическое действие (А.Д. Эрлих, Н.А. Грацианский. Рациональная фармакотерапия в кардиологии. 2014. Т. 10, №4. С. 448-456).

Однако мексидол имеет недостаточно высокую антиоксидантную активность и при этом характеризуется относительно высоким показателем кислотности: рН насыщенного раствора составляет 4.72 (измерено на рН-метре 410 АКВИЛОН), что может быть причиной нежелательных побочных эффектов при медицинском применении препарата.

Задачей изобретения является создание нового соединения, характеризующегося более высокой антиоксидантной активностью и меньшей кислотностью в сравнении с прототипом.

Решение поставленной задачи достигается созданием нового соединения, а именно соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I:

обладающей антиоксидантной активностью.

Решение поставленной задачи достигается также способом получения соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I, заключающимся в том, что смесь 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина основания и L-карнитина в эквимолярном соотношении кипятят в водно-этанольном растворе при перемешивании, охлаждают и отделяют целевой кристаллический продукт фильтрованием.

Сущность изобретения поясняется следующими иллюстрациями:

Фиг. 1. УФ спектр соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина в воде.

Фиг. 2. УФ спектр карнитина в воде.

Фиг. 3. УФ спектр 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина в воде.

Фиг. 4. ИК спектр соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина.

Фиг. 5. Масс-спектр соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина.

Фиг. 6. Кинетическая кривая тушения хемилюминесценции (ХЛ), сопровождающей инициированное окисление этилбензола заявляемым антиоксидантом КП ([КП]=5,2⋅10^-6 М).

Полученная соль 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I (далее КП) хорошо растворяется в воде, имеет низкую кислотность - рН_{насыщ.раствора}=7.62 (измерено на рН-метре 410 АКВИЛОН). При изучении антиоксидантной активности было установлено, что предлагаемое новое соединение КП значительно превосходит мексидол (см. пример 2).

Антиоксидантную активность заявляемого соединения определяли хемилюминес-центным методом, основанным на измерении интенсивности хемилюминесценции (ХЛ), сопровождающей инициированное окисление углеводородов и липидов молекулярным кислородом. В присутствии антиоксидантов происходит гашение ХЛ. Эта реакция подробно изучена и многократно опробована для исследования антиоксидантов (Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников Л.М., Захаров И.П., Вичутинский А.А., Цепалов В.Ф. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов. М: Наука, 1966, 300 с.; И.Ф. Русина, О.Н. Карпухин, О.Т. Касаикина. Хемилюминесцентные методы в исследовании ингибированного окисления. Химическая физика. 2013. Т. 32. №8. С. 49-64; Fedorova G.F., TrofimovA.V., Vasil'ev R.F., Veprintsev T.L. Peroxy-radical-mediated chemiluminescence: Mechanistic diversity and fundamentals for antioxidant assay. ARKIVOC 2007(8): 163-215).

Окисление углеводородов и липидов (RH) развивается по цепному свободнорадикальному механизму, ключевыми стадиями которого являются инициирование свободных радикалов инициатором (Y), продолжение цепей и обрыв цепей:

Инициирование радикалов: Y+RH→R•

Продолжение цепей: R•+О₂→ROO•

Продолжение цепей: ROO•+RH→ROOH+R•

Обрыв цепей при диспропорционировании

радикалов: ROO•+ROO•→ROH+кетон*+О₂

В процессах окисления углеводородов источником ХЛ является экзотермическая реакция диспропорционирования пероксильных радикалов (ROO^•). Эмиттером свечения является кетон в триплетном состоянии: кетон* →кетон+hν (кетон* - продукт реакции диспропорционирования пероксильных радикалов).

Введение антиоксиданта (InH) приводит к резкому уменьшению концентрации перекисных радикалов ROO• вследствие участия InH в реакциях обрыва цепей. Скорость инициированного окисления углеводорода RH при этом также резко снижается:

Ингибирование окисления RH антиоксидантом:

ROO•+InH→ROOH+In• - реакция протекает с константой скорости k_inh.

Обрыв цепей: ROO•+In•→нереакционноспособный продукт

Обрыв цепей: In•+In•→нереакционноспособный продукт.

Количественной мерой антиокислительной активности антиоксиданта служит величина константы скорости k_inh реакции ингибирования окисления: ROO•+InH→ROOH+In•, определяемая из кинетических параметров тушения ХЛ.

Кроме k_inh антирадикальную активность ингибитора характеризует также стехиометрический коэффициент ингибирования ƒ, зависящий от химической структуры ингибитора и показывающий, сколько цепей (радикалов) обрывается при участии одной молекулы антиоксиданта. Обычно 1<ƒ<2, но для некоторых антиоксидантов, содержащих несколько активных групп, коэффициент ƒ может составлять несколько единиц. Коэффициент ƒ связан с концентрацией антиоксиданта и зависит от кинетических параметров тушения ХЛ и скорости инициирования радикалов Wi (И.Ф. Русина и др. Химическая физика. 2013. Т. 32. №8. С. 54).

На примере инициированного окисления этилбензола (RH) исследована кинетика тушения ХЛ предлагаемым новым соединением КП (см. пример 2).

Приводим примеры, поясняющие изобретение.

Пример 1. Получение соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I (КП).

В колбу с магнитной мешалкой и обратным холодильником загружают 0,69 г (0,005 моль) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина основания в 10 мл 70%-ного медицинского спирта и добавляют раствор 0,8 г (0,005 моль) L-карнитина в 10 мл 70%-ного медицинского спирта. При работающей мешалке реакционную смесь нагревают до кипения и кипятят в течение 20 мин. Затем растворитель отгоняют наполовину в вакууме, охлаждают в течение 12 ч. в холодильнике, образовавшийся кристаллический продукт отделяют фильтрованием, промывают на фильтре ацетоном, сушат в вакууме. Получают 0,87 г КП (59% от теории) с Т_ПЛ=143-145°С (температуру плавления определяли на приборе «Franz Kustner Nachf. KG Dresden HMK-70/297»).

Найдено, %: С 57,00; H 8,87; N 8,80. C₁₅H₂₈N₂O₅. М.м. 316,38.

Вычислено, %: С 56,95; Н 8,92, N 8,85.

Карнитин является внутренней солью, и его карбоксильная группа не содержит кислотных протонов:

Образование соединения КП формулы I происходит с вовлечением молекулы воды, содержащейся в водно-этанольном растворе, по схеме:

В присутствии воды карнитин гидратируется, при этом положительный заряд на его азоте нейтрализуется гидроксилом молекулы воды, а на его карбоксильной группе появляется протон, позволяющий образовавшемуся гидрату карнитина взаимодействовать с 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридином (основанием) с образованием соли КП формулы I.

На Фиг. 1 и 2 приведены УФ, соответственно, спектры в воде полученной соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I (КП) при разных концентрациях и карнитина. В спектре КП наблюдаются три максимума поглощения (λ_макс), определены коэффициенты экстинкции (ξ):

На Фиг. 3 приведен УФ спектр в воде 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (основания) при разных концентрациях, наблюдаются три максимума поглощения (λ_макс), определены коэффициенты экстинкции (ξ):

Как видно из приведенных спектров, максимум поглощения при 192 нм, характерный для карнитина, в спектре полученного КП отсутствует. Спектры КП и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (основания) практически не отличаются.

На Фиг. 4 приведен ИК спектр полученного КП. ИК спектр КП с Фурье-преобразованием записан на спектрометре Tensor 27 (Bruker) с приставкой НПВО (Pike MIRacle) с фиксированным углом отражения на кристалле Ge в диапазоне частот 800-4000 см^-1 с 32 повторными сканированиями. Разрешение 4 см^-1. В таблице 1 показано отнесение обнаруженных полос поглощения.

На Фиг. 5. приведен масс-спектр полученного КП. Масс-спектр КП высокого разрешения получен на времяпролетном масс-спектрометре вторичных ионов TOF-SIMS.5 (ION-TOF, Германия). Спектры снимали, используя кластерные (трехатомные) ионы Bi₃⁺ с энергией 30 кеВ с площади 300×300 мкм, (ускоряющее напряжение 30 кВ) в положительных и отрицательных ионах. Разрешение по массе около 6500 для иона Н₃О+. Обнаружен катионированный натрием молекулярный ион m/z [М+Na₂]⁺: вычислено для [C₁₅H₂₇N₂O₅Na₂]⁺: 361.1740; найдено 361.1700.

Пример 2. Определение антиоксидантной активности полученной соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I (КП).

Готовили раствор КП в хлорбензоле и вносили в смесь, состоящую из растворов в хлорбензоле: этилбензола, инициатора радикалов - азо(бис)изобутиронитрила (Y) и активатора ХЛ - 9,10-дибромантрацена (DBA). Общий объем реакционной смеси составлял 5 мл. Концентрации компонентов в реакционном растворе: [КП]=5,2⋅10^-6 М; этилбензол 20%; [Y]=2⋅10^-3 М; [ДБА]=5⋅10^-3 М. Реакционным сосудом служила термостатированная при 50°С цилиндрическая стеклянная кювета. Реакционную смесь барботировали воздухом для ее насыщения кислородом и перемешивания.

На Фиг. 6 представлена кинетическая кривая тушения хемилюминесценции (ХЛ), сопровождающей инициированное окисление этилбензола заявляемым антиоксидантом КП ([КП]=5,2⋅10^-6 М). Видно, что интенсивность (I) ХЛ сразу после введения КП резко снижается, затем, по мере его расходования, постепенно восстанавливается практически до начального уровня (I₀). Время полувосстановления ХЛ, когда I становится равной половине I₀, называют "периодом индукции" - t_0,5.

Максимальный наклон (tgф) кинетической кривой тушения ХЛ I/I₀ в точке перегиба - в точке I/I₀=0.5 - позволяет определить константу скорости k_inh реакции ингибирования окисления (реакции антиоксиданта с перекисным радикалом) по формуле:

где k_t - константа скорости диспропорционирования пероксильных радикалов этилбензола (RH): ROO•+ROO•→ROH+кетон*+O₂; 2k_t=1.64⋅10⁷ (М⋅с)^-1 (И.Ф. Русина и др. Хим. физика. 2013. Т. 32. №8. С. 53); Wi - скорость инициирования радикалов; T_sec=t_0,5.

Скорость инициирования радикалов Wi рассчитывалась по известной формуле:

Wi=2е⋅k₀⋅[Y], где е - эффективность выхода радикалов из клетки, k₀ - константа скорости распада инициатора Y (Кинетика и катализ, 2014, том 55, №2, с. 157-162; Van Hook J.P., Tobolsky A.V. J. Amer. Chem. Soc. 1958. V. 80. P. 779).

Для концентрации инициатора [Y]=2⋅10^-3 M при температуре реакции 50°С скорость инициирования радикалов составила: Wi=1,12×10^-8 М⋅с^-1.

При известных Wi и 2k_t из кинетической кривой определяется k_inh.

Для заявляемого соединения - соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I (КП) - k_inh составляет 2,3⋅10⁵ (М⋅с)^-1.

Аналогичное исследование карнитина показало, что его добавки не влияют на кинетику ХЛ, то есть антиоксидантная активность отсутствует.

Для мексидола и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина k_inh были определены ранее (И.Ф. Русина, О.Н. Карпухин, О.Т. Касаикина. Химическая физика. 2013. Т. 32. №8. С. 58).

В таблице 2 приведены для сравнения k_inh и стехиометрический коэффициент ƒ некоторых известных антиоксидантов, в том числе «классического» антиоксиданта α-токоферола.

Как уже упоминалось выше, коэффициент ƒ связан с концентрацией антиоксиданта [InH] и зависит от кинетических параметров тушения ХЛ и скорости инициирования радикалов Wi. В точке перегиба кинетической кривой выполняется соотношение:

ƒ[InH]=Wi⋅t_0.5 (И.Ф. Русина и др. Химическая физика. 2013. Т. 32. №8. С. 54).

Таким образом, предлагаемое соединение - соль 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина (КП) проявляет высокую антиоксидантную активность, и, кроме того, характеризуется относительно низким показателем кислотности, что свидетельствует о возможности его применения для коррекции метаболических и сердечно-сосудистых нарушений, возникающих под влиянием окислительного стресса.

Изобретение относится к соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I, для применения в различных областях медицины для коррекции метаболических и сердечно-сосудистых нарушений под влиянием окислительного стресса. Также изобретение относится к способу получения соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I. Способ осуществляют путем кипячения смеси 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина основания и карнитина в эквимолярном соотношении, в водно-этанольном растворе. Затем охлаждают и отделяют целевой кристаллический продукт фильтрованием. Технический результат - соль 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина, обладающая антиоксидантной активностью. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Соль 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I:

обладающая антиоксидантной активностью.

2. Способ получения соли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидратом карнитина формулы I по п. 1, заключающийся в том, что смесь 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина основания и карнитина в эквимолярном соотношении кипятят в водно-этанольном растворе, охлаждают и отделяют целевой кристаллический продукт фильтрованием.