Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано на предприятиях биологической промышленности для производства средств специфической профилактики вирусного энтерита и чумы плотоядных.
Вирусный энтерит - острое специфическое заболевание норок, характеризуется воспалительно-некротическими поражениями желудочно-кишечного тракта, мезентериальных лимфатических узлов и селезенки; поражает норок всех возрастов, но чаще всего молодняк, отход среди которого составляет от 10 до 50% .
Чума плотоядных - также остропротекающее контагиозное заболевание плотоядных, в том числе и норок, характеризующееся лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек дыхательного и пищеварительного трактов, поражением нервной системы и кожи; поражает представителей семейств псовых и куньих всех возрастов, но наиболее восприимчив молодняк животных, среди которых отход составляет до 70-80% .
Указанные заболевания являются одной из основных причин отхода молодняка в раннем возрасте, наносящего большой экономический ущерб.
В настоящее время иммунизацию пушных зверей проводят раздельно.
Известен способ получения вакцины и иммунизации против чумы плотоядных, согласно которому молодняку зверей в возрасте 8-10 недель вводят парентерально вакцину, содержащую невирулентный вирус чумы, адаптированный в культуре клеток японских перепелов, в дозе 100-200 ТЦД50.
Также известен способ получения вакцины и иммунизации против вирусного энтерита норок. В период после создания иммунитета против чумы плотоядных, т. е. в возрасте 12-14 недель, молодняку норок вводят инактивированную вакцину, полученную на основе вируса, выращенного в первично-трипсинизированной культуре клеток почки котенка, в питательной среде, содержащей среду Иглу и сыворотку крупного рогатого скота.
Известные способы иммунизации против чумы и вирусного энтерита имеют ряд недостатков.
При раздельном способе иммунизации щенков привитые против чумы в возрасте 8-10 недель оказываются незащищенными в отношении вирусного энтерита. Для создания напряженного иммунитета против вирусного энтерита требуется дополнительно 4-5 недель после вакцинации зверей против чумы.
Ввиду того, что щенки в возрасте с 7 недель обладают повышенной восприимчивостью к вирусному энтериту, среди них наблюдается значительный отход при попадании вируса энтерита.
Целью изобретения является повышение иммуногенности противочумной вакцины и создание напряженного иммунитета в более раннем возрасте у молодняка норок против обоих заболеваний.
Поставленная цель достигается тем, что к энтеритному компоненту с титром вируса 104,0-104,5 ИД50/мл добавляют метабисульфит натрия в конечной концентрации 2,8-4,3 г/л и используют его в качестве растворителя чумного компонента (с титром 102,8-104,3 ТЦД50/мл) соотношении 1 : 1. Готовую к употреблению вакцину применяют для иммунизации норок в возрасте 8-10 недель. Вакцинацию проводят в течение 2 ч с момента смешивания в дозе по 1 мл. внутримышечно при содержании в прививочной дозе вируса чумы 102,0-103,0 ТЦД50/мл и антигена вирусного энтерита 104,0-104,5 ИД50/мл.
П р и м е р 1. Изготовление чумного компонента.
Аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных выращивают.
Используют аттенуированный штамм "ЭПМ" вируса чумы плотоядных, депонированный под номером "10-76", который получен путем многократных пассажей дикого вируса в культурах клеток животных и человека.
Для изготовления чумного компонента вирус выращивают на культуре первично-трипсинизированных клеток эмбрионов японских перепелов в питательной среде, содержащей раствор гидролизата лактальбумин или среду 199 и сыворотку крупного рогатого скота. Полученную вируссодержащую жидкость с вакцинным штаммом вируса лиофильно высушивают, чтобы сохранить длительное время без потери активность живого вакцинного вируса в присутствии 4,5-5% массы сорбита и 1,4-6% массы желатозы. Чумной компонент хранят при плюс 4-6оС в течение 1 года. Титр вируса в сухой вакцине равен 102,8-104,3 ТЦД50/мл.
П р и м е р 2. Изготовление энтеритного компонента.
Энтеритный компонент ассоциированной вакцины готовят путем выращивания в первично-трипсинизированной культуре клеток почки котенка 2-6-месячного возраста вирулентного штамма вируса энтерита норок (штамм "Родники", депонированный по N "Р-1631"). После трипсинизации в суспензию клеток вносят ультрафильтрат нативного вируса энтерита норок "Р" и выращивают в питательной среде, включающей среду 199 и сыворотку крупного рогатого скота, при температуре 37оС в течение 9-11 дней. По достижении титра гемагглютинации не ниже 1 : 16 - 1 : 64 ГАЕ/мл проводят первый слив культуральной жидкости, добавляют на монослой клеток поддерживающую среду и снова инкубируют в течение 3-4 дней. Первый слив культуральной жидкости хранят при 2-4оС. По истечении этого срока матрасы с содержимым замораживают при температуре минус 20оС, затем оттаивают. Все вирусные сборы объединяют и определяют титр вируса, который должен быть по РГА не ниже 104 ИД50/мл. Культуральный вирус энтерита норок инактивируют раствором формальдегида в соотношении 0,1% формалина к объему вируса. Инактивацию проводят при 37оС в течение 20 ч. После инактивации вирусный сбор проверяют на стерильность путем высева на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом в среду Сабуро, после чего вносят 3% -ный раствор гидроокиси алюминия в соотношении 10-15% к объему вирусного сбора, тщательно перемешивают и фасуют.
П р и м е р 3. Приготовление ассоциированной вакцины против чумы и вирусного энтерита (табл. 1).
К вируссодержащему материалу из примера 2 с титром по РГА 104,0 - 104,5 ИД50/мл добавляют на фосфатно-буферном растворе 20% -ный раствор метабисульфита натрия в конечной концентрации 0,8; 1,4; 2,0; 2,8; 3,2; 4,0; 4,3; 5,0 и 5,8 г/л. К 1 мл каждой из полученных проб с различным содержанием метабисульфита натрия в энтеритной вакцине добавляют по 1 мл культуральной жидкости, содержащей вакцинный вирус чумы в титре 103,8 ТЦД50/мл.
В табл. 1 показано, что при значениях концентрации метабисульфита натрия 2,0 и меньше титры вируса чумы снижаются с 102,3 до 101,3 ТЦД50/мл. Также из табл. 1 видно, что вирус чумы в наиболее высоких титрах получают (сохраняется) в смеси при конечных концентрациях метабисульфита натрия, равных 2,8; 3,2; 4,0 и 4,3 г/л. Дальнейшее повышение концентрации метабисульфита натрия не оказывает существенного влияния на титры вируса чумы. Уменьшение содержания метабисульфита натрия приводит к снижению титра вируса чумы.
Таким образом, оптимальным можно считать содержание метабисульфита, равное 2,8-4,3 г/л.
П р и м е р 4. Сохранность вируса чумы в смешанной вакцине при различной длительности контакта с энтеритным растворителем
Материал, полученный в примере 3, выдерживают при комнатной температуре в течение различных промежутков времени. Из табл. 2 видно, что при содержании метабисульфита натрия, взятого в рабочей концентрации, в течение 2 ч титры вируса чумы сохраняются в значениях, достаточных для создания напряженного иммунитета. Более длительное выдерживание смеси приводит к снижению титров вакционного вируса чумы.
В
П р и м е р 5. Влияние срока хранения на иммуногенность чумного компонента в смешанной вакцине
Данное определение проводят в биопробах на норках с заражением вакцинированных и контрольных зверей вирулентным штаммом вируса чумы; в исследованных сыворотках крови вакцинированных и контрольных зверей определяли уровень титров противочумных антител в реакции нейтрализации (рН) цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток. Состояние иммунитета у норок определяли через 1 месяц после вакцинации ассоциированным препаратом.
Из табл. 3 видно, что при сроке хранения смешанной вакцины в течение 2 ч из 5-ти вакцинированных после заражения вирусом чумы остались живы все 5 норок. В то же время титры антител были равны в среднем 1 : 32. Увеличение срока хранения смеси вирусных компонентов более 2 ч снижает иммуногенное действие препарата, что приводит к увеличению количества погибших животных после контрольного заражения вирусом чумы и резкому снижению титров противочумных антител в сыворотках крови вакцинированных.
П р и м е р 6. Контроль иммуногенности ассоциированной вакцины.
Оценку защитного действия вакцины, полученной в предыдущих примерах, проводят на щенках норки старше 8-10 недель. Перед вакцинацией готовят смесь, включающую чумной и энтеритный компоненты в титрах соответственно 3,8 ТЦД50/мл и 4,0 ИД50/мл, смешивая их в равных соотношениях. Для этого полученную партию смешанной вакцины вводят внутримышечно 10 неимунным норкам в объеме по 1 мл. Через 4 недели после иммунизации по 5 иммунизированных и 5 контрольных (неиммунных) норок заражают вирулентным вирусом чумы плотоядных (штамм Снайдер Хилл) в дозе по 103 ЛД50. Других 5 иммунизированных и 5 контрольных (неиммунных) норок заражают вирусом энтерита, штамм "Родники" в дозе по 104 ИД50/норку.
Для сравнения 5 норкам вводят моновакцину против чумы из штамма ЭПМ, а 5 другим норкам вводят вакцину против вирусного энтерита из штамма "Родники". Через 1, 3, 6, 9 и 12 мес у всех иммунизированных и контрольных животных берут пробы сыворотки крови для определения титров антител. Полученные результаты представлены в табл. 4 и 5.
В течение первых 6-ти месяцев титры антител в пробах сыворотки крови при иммунизации по предлагаемому способу были достоверно выше по сравнению с иммунизацией моновакциной.
Как видно из табл. 4 противочумные антитела обнаруживаются в достаточных титрах через 12 мес после вакцинации как ассоциированной, так и моновакциной.
Как видно из табл. 5, противоэнтеритные антитела постоянно присутствуют в пробах сыворотки крови в достаточных титрах через 12 мес после вакцинации как ассоциированной, так и моновакциной. У контрольных, невакцинированных норок антитела появлялись через 3 месяца в более низких титрах, чем у вакцинированных норок, в результате спонтанного пассирования на зверях слабо вирулентных штаммов энтерита норок.
Технико-экономическая эффективность.
При широком производственном испытании в норковедческих хозяйствах предлагаемого метода профилактики чумы и вирусного энтерита с помощью испытуемой вакцины не было отмечено ни в одном случае прорыва иммунитета.
В течение 1987-89 гг. изготовлено в биоцехе 4,5 млн. доз модифицированной энтеритной вакцины (растворитель для сухой вакцины против чумы плотоядных) и реализовано более чем в 50 зверохозяйствах различных регионов страны. Иммунизация норок данным препаратом показала себя только с положительной стороны. Предлагаемая вакцина создает напряженный иммунитет в течение не менее 12 мес, позволяет в 2 и более раза сокращать материальные и трудовые затраты при ее изготовлении и применении, создает иммунитет против обеих инфекций в более короткие сроки, а также позволяет увеличивать производительность труда, экономя рабочую силу на ферме. Этим значительно сокращаются расходы на профилактическую обработку многотысячного поголовья норок зверосовхозов. (56) Авторское свидетельство СССР N 1221787, кл. A 61 K 39/12, 1980.
Патент США N 4224412, кл. C 12 N 7/00, 1980.
Использование: вирусология. Сущность изобретения: для профилактики чумы плотоядных лиофилизированную вакцину против чумы плотоядных регидратируют инактивированным формалином вирус энтерита норок с титром 104,0-4,5ИД50/мл с добавлением метабисульфита натрия в конечной концентрации 2,8 - 4,3 г/л. Растворитель добавляют к вакцине в равных соотношениях. Введение осуществляют животным в возрасте 8 - 10 недель однократно в течение 2 ч с момента регидратации вакцины. 5 табл.
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ, включающий регидратацию лиофилизированной вакцины против чумы плотоядных растворителем с последующим введением животным, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют инактивированный формалином вирус энтерита норок с титром 104,0 - 104,5 ИД50/мл с добавлением метабисульфита натрия в конечной концентрации 2,8 - 4,3 г/л, растворитель добавляют к вакцине в равных соотношениях, а введение осуществляют животным в возрасте 8 - 10 недель однократно с течение 2 ч с момента регидратации вакцины.
