ВАКЦИНА ПРОТИВ ЧУМЫ, ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА И ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ПЛОТОЯДНЫХ Российский патент 2000 года по МПК A61K39/295 C12N7/00 A61K39/175 A61K39/245 A61K39/23 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к средствам специфической профилактики чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита собак.

Для профилактики этих болезней используют живые и инактивированные моно- и ассоциированные вакцины, полученные как на основе первичных, так и перевиваемых клеточных культур.

Для иммунизации плотоядных, в том числе собак, против чумы применяют культуральные вакцины из штаммов ЭПМ, ВНИИВВиМ-88, 668-КФ, Рокборн, модифицированного Снайдер-Хилл и других (Автор, св-ва СССР кл. C 12 N 7/08 N 527072, 1977; кл. A 61 K 39/12 N 1287592, 1984. Патенты США кл. 424-89 N 4224412, 1980; N 4351827, 1982; N 5000951, 1991).

Для защиты от инфекционного гепатита используют преимущественно препараты из штамма Корнелл, а также аденовирусы собак типа 1 и 2 (Патенты США кл. 195-1.3 N 3432391, 1969; кл. 195-1.8 N 3616203, 1971; кл. 424/89 N 3950512, 1976. Патент РФ кл. A 61 K 39/295, N 2030917, 1995).

Вакцины против парвовирусного энтерита в своем составе содержат живые аттенуированные и инактивированные вирулентные штаммы парвовирусов собак, панлейкопении кошек и энтерита норок (Патенты США кл. 424-89, N 4193990, 1980; N 4303645, 1981; N 4810494, 1989. Автор. св-ва. ЧССР кл. A 61 K 39/23 N 262736, 1988; N 252746, 1988; N 252747, 1988. Патент РФ кл. A 61 K 39/23 N 871371, 1994. ТУ 46-21-705-80 на вакцину культуральную против вирусного энтерита норок).

Для формирования иммунитета против перечисленных инфекций в наиболее короткие сроки при меньших затратах труда и снижении риска осложнений, возникающих из-за стрессовых явлений при проведении прививок против каждой болезни, успешно применяют ассоциированные вакцины (Патент Англии кл. A 61 K 3/62 N 1016586, 1966. Патент США кл. 424-89 N 5000951, 1991. Автор. св-ва. ЧССР кл. A 61 K 39/295 N 267937, 1989. Патент РФ кл. A 61 K 39/295, N 2030917, 1995. ТУ 08064-019-004-94 на вакцину жидкую инактивированную против парвовирусного энтерита и гепатита плотоядных. ТУ 10-09-98-91 на вакцину сухую культуральную против чумы, гепатита и парвовируса плотоядных).

Наиболее близкой по составу (прототипом предлагаемого препарата) является вакцина сухая культуральная против чумы, гепатита и парвовируса плотоядных, содержащая штаммы: "668-КФ" вируса чумы плотоядных, "Корнелл-2" вируса инфекционного гепатита собак и "А" вируса панлейкопении кошек, разработанная сотрудниками Покровского завода биопрепаратов (ТУ 10-09-98-91). Основной ее недостаток заключается в том, что для получения вируссодержащих материалов используются дорогостоящие, нестандартные, малотехнологичные и не свободные от контаминантов первично трипсинизированные культуры клеток: из тканей куриного эмбриона ("668-КФ"), почки поросенка ("Корнелл-2") и почки котенка ("А"). Кроме того, штамм "668- КФ" обладает сравнительно невысокой иммуногенностью. На необходимость доработки этой вакцины указывалось в приказе по Главному управлению ветеринарии МСХ и ПРФ (1993 г).

Целью данного изобретения является вакцина ассоциированная сухая против чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита плотоядных, обладающая высокой иммуногенной активностью, безвредностью, стабильностью при хранении и высокой технологичностью производства.

Поставленная цель достигается тем, что вакцина содержит новый аттенуированный штамм "ВНИИВВиМ-88" вируса чумы плотоядных (ВЧП), с инфекционной активностью 3,5-4,5 lg ТЦД 50/см³, выращенный в сублинии CV-1 перевиваемых клеток почки африканской зеленой мартышки, штамм "Корнелл-2" вируса инфекционного гепатита собак (ВИГС) с инфекционной активностью 5,5-6,5 lg ТЦД 50/см³, выращенный в перевиваемой культуре клеток тестикул поросенка (ПТП), и штамм "А" вируса панлейкопении кошек (ВПК) с инфекционной активностью 3,5-4,5 lg ИД 50/см³ и гемагглютинирующей активностью в РГА 1:32-1:512, выращенный в перевиваемой культуре клеток почки котенка (сублиния Fk), а также среду высушивания, включающую лактозу, сахарозу, сорбит и желатин, при следующем соотношении компонентов, об.%:
Вирусная суспензия штамма "ВНИИВВиМ-88" с титром инфекционной активности 3,5-4,5 lg ТЦД 50/см³ - 32-33
Вирусная суспензия штамма "Корнелл-2" с титром инфекционной активности 5,5-6,5 lg ТЦД 50/см³ - 9-11
Вирусная суспензия штамма "А" с титром инфекционной активности 3,5-4,5 lg ИД 50/см³ и гемагглютинирующей активностью в РГА 1:32-1:512 - 32-33
20%-ный раствор лактозы - 4,8-5,2
60%-ный раствор сахарозы - 4,8-5,2
40%-ный раствор сорбита - 4,8-5,2
20%-ный раствор желатина - Остальное
Культивирование трех вышеуказанных штаммов проводится высокотехнологичным роллерным способом с использованием высокорепродуктивных, стандартных, не туморогенных перевиваемых линий клеток, которые используются в институте при выращивании различных вирусов.

Для выращивания вируса чумы плотоядных используют сублинию CV-1 монослойной культуры клеток, полученную во ВНИИВВиМ из исходной культуры перевиваемых клеток CV-1 (USA, ATCC, CCL 70) почки африканской зеленой мартышки (номер 43.2 в каталоге клеточной коллекции ВНИИВВиМ). Банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) сублинии CV-1 содержит клетки 17 пассажа в количестве 165 млн. клеток. Монослойную культуру клеток сублинии CV-1, полученную серийным пассированием с коэффициентом пересева 1:3-1:5, используют в пределах 50 последовательных пассажей.

Для выращивания вируса инфекционного гепатита собак используют монослойную культуру перевиваемых клеток ПТП, полученную институтом из Украинского научно-исследовательского ветеринарного института в 1989 году. (Номер культуры 10.5 в каталоге клеточной коллекции ВНИИВВиМ. БРКИ содержит клетки 7-15 пассажей в количестве 120 млн. клеток. Монослойную культуру клеток ПТП используют для культивирования вируса в пределах 50 последовательных пересевов.

Для выращивания вируса панлейкопении кошек используют монослойную культуру клеток сублинии FK, полученную во ВНИИВВиМ из исходной перевиваемой линии почки кошки CRFK (USA, ATCC, CCL 94). Сублиния зарегистрирована под номером 34.1 в каталоге клеточной коллекции ВНИИВВиМ. БРКИ сублинии FK содержит клетки 22-47 пассажей в количестве 100 млн. клеток. Монослойную культуру клеток сублинии FK, полученную серийным пассированием с коэффициентом пересева 1:2-1:4, используют в течение 50 последовательных пересевов.

Вакцинный штамм "ВНИИВВиМ-88" (регистрационный номер "ВНИИВВиМ-88 Деп" в коллекции ВГНКИ) получен из штамма ЭПМ путем адаптации его к сублинии CV-1 посредством серии перемежающихся пассажей и последующим клонированием методом предельных разведений. Новый штамм характеризуется следующими свойствами:
- обладает морфологическими свойствами, характерными для вируса чумы плотоядных рода Morbillivirus семейства Paramyxoviridae;
- размножается в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1 с развитием ярко выраженного ЦПД в виде симпластов и последующей деструкцией клеток, титр вируса в указанной культуре достигает 3,5-4,5 lg ТЦД 50/см³. Без адаптации вирус размножается в культуре клеток из тканей куриных и перепелиных эмбрионов, вызывая специфическое ЦПД и накапливаясь в титрах до 3,0-4,0 lg ТЦД 50/см³;
- культивируется в монослое перевиваемых клеток сублинии CV-1 в стационарных и роллерных условиях, при оптимальных режимах максимум биологической активности достигается через 44-52 час;
- безвреден для лабораторных и восприимчивых животных, неконтагиозен, нереверсибелен, непатогенен для человека;
- индуцирует формирование напряженного и продолжительного иммунитета против чумы у вакцинированных пушных зверей (норок, тхорзофреток, песцов, лис, енотов) и собак;
- вызывает образование вируснейтрализующих антител в титрах 1:8-1:32 и выше; гемагглютинирующими свойствами не обладает;
- генетически стабилен в течение 10 последовательных пассажей в культуре клеток сублинии CV-1.

Вакцину против чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита плотоядных вводят взрослым собакам однократно в объеме 2 см³, а щенкам - двукратно с интервалом 14-30 сут в объеме 1 см³.

Пример 1.

Вируссодержащие материалы всех трех штаммов выращивают в монослойных перевиваемых культурах клеток с использованием роллерной установки производительностью до 50 дм³ за один цикл.

Вирусную суспензию вакцинного штамма ВНИИВВиМ-88 вируса чумы плотоядных получают в сублинии CV-1 перевиваемых клеток. В качестве ростовой среды применяют среду Игла-МЭМ с 10 об.% сыворотки крови КРС. В качестве поддерживающей используют среду Игла-МЭМ с 5об.% сыворотки крови КРС.

Производственный штамм "ВНИИВВиМ-88" ВЧП с титром не ниже 3,5 lg ТЦД 50/см³ вносят по 20 см³ в роллерные сосуды со сформированным 1-2-суточным монослоем клеток, предварительно слив из них ростовую среду. Контакт вируса с клетками проводят в течение 30 - 40 мин при температуре 36,5 - 37,5^oC, затем в каждый сосуд добавляют по 480 см³ среды поддержки, pH 7,2-7,4.

Культивирование вируса проводят при температуре 36,5-37,5^oC и скорости вращения сосудов 10-12 об. в час. Через 40-48 час при проявлении специфического ЦПД у 50% клеток вирусную суспензию сливают, предварительно взяв пробы из каждого сосуда для контроля на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами и определения титра вируса по ЦПД в культуре клеток сублинии CV-1. После замораживания при температуре минус 60^oC и оттаивания при 25^oC полученный вирус сливают в одну емкость.

Вирусную суспензию вакцинного штамма "Корнелл-2" ВИГС получают в перевиваемой культуре клеток ПТП. В качестве ростовой среды применяют среду Игла-МЭМ с 10 об.% сыворотки крови КРС. В качестве ростовой и поддерживающей сред применяют среды Игла-МЭМ с 10 и 5 об.% сыворотки крови КРС соответственно.

Производственный штамм "Корнелл-2" вируса ИГС с титром не ниже 5,5 lg ТЦД 50/см³ вносят по 6 см³ в роллерные сосуды со сформированным 1-2-суточным монослоем клеток, предварительно слив из них ростовую среду. Контакт вируса с клетками проводят в течение 60 - 90 мин при температуре 36,5 - 37,5^oC, затем в каждый сосуд добавляют по 494 см³ среды поддержки, pH 7,2-7,4.

Культивирование вируса проводят при температуре 36,5-37,5^oC и скорости вращения сосудов 10-12 об. в час. Через 36-48 час при проявлении специфического ЦПД у 50-70% клеток вирусную суспензию сливают, предварительно взяв пробы из каждого сосуда для контроля на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами и определения титра вируса по ЦПД в культуре клеток ПТП. После замораживания при температуре минус 60^oC и оттаивания при 25^oC полученный вирус сливают в одну емкость.

Вирусную суспензию вакцинного штамма "А" ВПК получают в перевиваемой культуре клеток Fk. В качестве ростовой и поддерживающей сред применяют среды Игла-МЭМ с 10 и 5 об.% сыворотки крови КРС соответственно.

Производственный штамм "А" ВПК с титром не ниже 3,5 lg ИД 50/см³ вносят по 20 см³ в роллерные сосуды со сформированным 1-2-суточным монослоем клеток, предварительно слив из них ростовую среду. Контакт вируса с клетками проводят в течение 60 - 90 мин при температуре 36,5 - 37,5^oC, затем в каждый сосуд добавляют по 480 см³ среды поддержки, pH 7,2-7,4. Культивирование вируса проводят при температуре 36,5-37,5^oC и скорости вращения сосудов 10-12 об. в час. Через 6 суток вирусную суспензию сливают, предварительно взяв пробы из каждого сосуда для контроля на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами, определения биологической активности в культуре клеток Fk и гемагглютинирующей активности в РГА. После замораживания при температуре минус 60^oC и оттаивания при 25^oC полученный вирус сливают в одну емкость.

В табл. 1 приведены результаты трех опытов получения вируссодержащих материалов, используемых для производства вакцины.

Контаминация бактериями, грибами и микоплазмами отсутствовала.

Как видно из табл. 1, все серии вируссодержащего материала, полученные на основе перевиваемых культур клеток, были стабильными по своим показателям и обладали высокой активностью.

Пример 2
К 3,2 дм³ вируса чумы плотоядных добавляют 3,2 дм³ вируса панлейкопении кошек и 0,9 дм³ вируса инфекционного гепатита собак. К полученной смеси вирусов при тщательном перемешивании на шуттель-аппарате добавляют среду высушивания, содержащую по 0,48 дм³ 20% раствора лактозы, 60% раствора сахарозы и 40% раствора сорбита, 1,26 дм³ 20% раствора желатина и антибиотики - бензилпенициллина 200 ЕД/см³, мономицина 200 ЕД/см³ и полимиксина 100 ЕД/см³. Устанавливают величину pH 6,6 с помощью янтарной кислоты в конечной концентрации 6%.

Аналогичным образом готовят еще 2 серии вируссодержащей смеси при следующих количествах компонентов (дм³) (см. в табл. 2).

Полученные смеси фасуют по 2 см³ в стерильные ампулы (серии 1 и 2), стеклянные флаконы (серия 3) и лиофилизируют. Всего изготовлено 15000 иммунизирующих доз для собак (по 1 дозе во флаконе и ампуле).

Пример 3
Комиссионно (с участием ОБК института) 3 серии вакцины изучены по следующим показателям: биологической активности, безвредности, реактогенности и иммуногенной активности. Требования на вакцину изложены в технических условиях ТУ 9384-051-00008064-96 "Вакцина против чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита плотоядных культуральная сухая", одобренных в 1996 г. Департаментом ветеринарии МСХ и ПРФ.

Биологическую активность вакцины определяют путем титрования вакцинных штаммов в культурах клеток: ВЧП в культуре клеток сублинии CV-1, ВИГС в культуре клеток ПТП, ВПК в культуре клеток сублинии Fk. Активности штаммов в сухой вакцине должны составлять: "ВНИИВВиМ-88" ВЧП - 2,75-3,75 lg ТЦД 50/см³, "Корнелл-2" ВИГС - 3,0-4,5 lg ТЦД 50/см³, "А" ВПК - 3,0-4,5 lg ИД 50/см³.

Безвредность вакцины определяют на собаках 2-4 мес возраста массой не менее 3 кг, клинически здоровых, не вакцинированных против исследуемых болезней, прошедших дегельминтизацию. Четырем собакам вводят в мышцы бедра по 5 см³ вакцины. За животными проводят клиническое наблюдение в течение 21 сут. Все привитые животные должны оставаться живыми и здоровыми в период наблюдения. Допускается в течение 1-3 сут. отказ или неполное поедание корма, а также разжижение кала.

Реактогенность вакцины определяют на собаках 2-4 мес. возраста массой не менее 3 кг, клинически здоровых, не вакцинированных против исследуемых болезней, прошедших дегельминтизацию. Четырем собакам вводят вакцину в мышцы бедра в объеме 1 прививочной дозы (2 см³). За привитыми животными проводят клиническое наблюдение в течение 21 сут. Вакцина считается ареактогенной, если у всех привитых животных не отмечается отклонений от физиологической нормы в течение срока наблюдения. Допускается в течение 1-2 сут. отказ от корма и не полное его поедание, а также разжижение кала.

Иммуногенную активность вакцины против чумы плотоядных определяют на тхорзофретках 2-2,5 месячного возраста, полученных из благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям хозяйств, клинически здоровых, не вакцинированных против чумы и не в период гона. Вакцину вводят 4 тхорзофреткам внутримышечно по 1 см³, содержащему 500-1000 ТЦД 50 ВЧП. Через 21 сутки после вакцинации привитых и 4 контрольных животных заражают вирулентным штаммом "Снайдер Хилл" в дозе по 1000 ЛД 50 внутримышечно. Срок наблюдения 25 суток. Вакцина считается иммуногенной, если она предохраняла от заражения и гибели всех однократно привитых тхорзофреток при гибели 4 животных в контрольной группе.

Иммуногенную активность вакцины против парвовирусного энтерита определяют на норках 2-6 мес. возраста, полученных из благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям хозяйств, клинически здоровых, не вакцинированных против чумы и не в период гона. Вакцину вводят 4 норкам внутримышечно по 1 см³, содержащему 1000 ИД 50 вируса ПК. Через 21 сутки после вакцинации привитых и 4 контрольных животных заражают вирулентным штаммом "Родники" в дозе по 1000 ИД 50 внутримышечно. Срок наблюдения 14 суток. Вакцина считается иммуногенной, если она предохраняла от заражения и гибели всех однократно привитых норок при гибели 4 животных в контрольной группе. Допускается выживание двух контрольных норок при переболевании их ПЭ с характерными признаками болезни.

Иммуногенную активность вакцины против инфекционного гепатита определяют на щенках собак 2-4 месячного возраста, вышедших из опыта по определению реактогенности. Через 21 сутки после вакцинации привитых и 4 контрольных животных заражают вирулентным штаммом "Карабаш" в дозе по 1000 ИД 50 интраперитонеально (5 см³) и в коньюнктиву глаза (0,2 см³). Срок наблюдения 25 суток. Вакцина считается иммуногенной, если она предохраняет от заболевания всех однократно привитых щенков. А у контрольных животных отмечают подъем температуры до 40,3-41^oC, угнетенное состояние, отказ от корма, кератиты части роговицы. Возможна гибель щенков на 18-25 сут.

Результаты комиссионных испытании 3-х серий вакцины суммированы в таб. 3.

Установлено, что в сухой вакцине инфекционная активность вакцинного штамма "ВНИИВВиМ-88" составляла 3,0-3,75 lg ТЦД 50/см³, штамма "Корнелл-2" - 3,75-4,5 lg ТЦД 50/см³, штамма "А" - 3,0-4,0 lg ИД 50/см и в РГА 1:8-1:256. Вакцина была безвредной и ареактогенной для собак, иммуногенной для тхорзофреток, собак и норок. После двукратной вакцинации щенков (вторая прививка через 14-30 сут. ) у животных выявляли вируснейтрализующие и задерживающие гемагглютинацию антитела, которые достигали максимального титра через 10-14 сут. после вторичной иммунизации: против ВЧП - 1:64 - 1:128, против ВИГС - 1: 16 - 1:64, против ВПК - 1:64- 1:512. Антитела против трех инфекций обнаруживались у вакцинированных собак в течение 12 мес. после прививки, снижаясь при этом на 1-2 порядка.

Все иммунобиологические характеристики 3-х серий вакцины соответствуют требованиям ТУ-9384-051-00008064-96 и сохраняются в течение 12 мес. хранения при температуре 4-6^oC в пределах заданных нормативов.

Применение новой вакцины против чумы, инфекционного гепатита и паровирусного энтерита плотоядных в ветеринарной практике позволит снизить заболеваемость собак этими болезнями и повысить эффективность проводимых противоэпизоотических мероприятий.

Изобретение относится к средствам специфической профилактики чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита собак. Вакцина содержит новый аттенуированный штамм "ВНИИВВиМ-88" вируса чумы плотоядных с инфекционной активностью 3,5-4,5 lg ТПД 50/см³. Штамм выращивают в сублинии CV-1 перевиваемых клеток почки африканской зеленой мартышки. Вакцина также содержит вакцинный штамм "Корнелл-2" вируса инфекционного гепатита собак с инфекционной активностью 5,5-6,5 lg ТПД 50/см³. Штамм выращивают в перевиваемой культуре клеток тестикул поросенка (ПТП). Кроме того, в ее состав входит вакцинный штамм "А" вируса панлейкопении кошек с инфекционной активностью 3,5-4,5 lg ТПД 50/см³ и гемагглютинирующей активностью в РГА 1:32 - 1:512. Штамм выращивают в перевиваемой культуре клеток почки котенка (сублиния Fk). В вакцину входит также среда высушивания на основе лактозы, сахарозы, сорбита и желатина. Вакцина характеризуется безвредностью, ареактогенностью, высокой антигенной и иммуногенной активностью, стабильностью при хранении, стандартностью и высокой технологичностью получения. 3 табл.

Вакцина против чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита плотоядных, включающая лиофилизированную смесь трех культуральных вакцинных штаммов и среду высушивания, отличающаяся тем, что содержит при эффективных концентрациях, об.%:
Суспензию нового вакцинного штамма "ВНИИВВмМ-88" чумы плотоядных, выращенного в сублинии СУ-1 перевиваемых клеток почки зеленой мартышки с титром инфекционной активности 3,5 - 4,5 lg ТПД 50/см³ - 32 - 33
Суспензию вакцинного штамма "Корнелл-2" инфекционного гепатита собак, выращенного в перевиваемой культуре клеток тестикул поросенка гнотобиота с титром инфекционной активности 5,5 - 6,5 lg ТПД 50/см³ - 9/11
Суспензию вакцинного штамма "А" панлейкопении кошек, выращенного в перевиваемой культуре клеток почки котенка сублиния Fk с титром инфекционной активности 3,5 - 4,5 lg ИД 50/см³ и гемагглютинирующей активности 1 : 32 - 1 : 512 - 32 - 33
20%-ный раствор лактозы - 4,8 - 5,2
60%-ный раствор сахарозы - 4,8 - 5,2
40%-ный раствор сорбита - 4,8 - 5,2
20%-ный раствор желатина - Остальное