Изобретение относится к защите растений, может использоваться в селекционной практике в целях выведения сортов люцерны, устойчивых к болезни, и представляет собой штамм гриба, вызывающий опасное заболевание люцерны - корневую гниль (фитофтороз).
Известны штаммы видов низших грибов Pythium ultimum frow. var. ultimum Nit и Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp. , поражающие всходы люцерны, а также бобовые, свеклу и другие с-х. растения и широко встречающиеся на этих культурах в различных регионах страны. Однако их патогенность на люцерне сравнительно низкая и использование их в селекции люцерны на устойчивость к болезням не представляется целесообразным. Штамм гриба Fusarium oxysporum Shlecht var. medicaginis - возбудителя корневой гнили люцерны, принятой за прототип и который обладает более высокой патогенностью по отношению к люцерне, чем вышеназванные возбудители, используется в селекционной работе. Однако он является недостаточно эффективным и не позволяет вести в ряде регионов страны целенаправленный поиск генотипов устойчивости к корневой гнили, вызывающей комплексом возбудителей, среди которых доминирующим является патоген Ph. megasperma v. medicaginis.
Цель изобретения - получение штамма Ph. megasperma v. megicaginis - вирулентного по отношению к люцерне в целях использования его в селекционной практике для создания инфекционного фона и изучения сортоустойчивости люцерны, разработки экспресс-методов определения устойчивости и использовании его в биотехнологии и как модельного штамма в генетических исследованиях. Это было достигнуто путем выделения штамма в чистую культуру из пораженной ткани корней люцерны, культивируемой в производственных посевах в Киргизской ССР. При изолировании Ph. medasperma v. medicaginis была использована подкисленная кукурузно-мучная (30 г кукурузной муки на 1 л воды) агаризованная среда (15 г агар-агара на 1 л среды) с добавлением антибиотиков: сернокислого стрептомицина 50 мг/л и фунгицида пентахлонитробензола в количестве 50 мг/л среды для подавления вторичных полупаразитных и сапротрофных микроорганизмов. Кроме вышеуказанного для выделения гриба были использованы различные методы.
Штамм хранится в коллекции чистых культур Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под N Д-47.
Культурально-морфологические особенности штамма. Ph. megasperma хорошо растет на искусственных питательных средах. Культуральные особенности штамма варьируют в зависимости от состава питательной среды, ее кислотности.
Наиболее благоприятной средой для культивирования является подкисленная кукурузно-мучная агаризованная среда и томатная агаровые среды, а также отвары, приготовленные из зерен фасоли, кукурузы, гороха, томатов.
На кукурузно-мучной агаровой среде, включающей 30 г кукурузной муки, 15 г агар-агара на 1 л водопроводной воды с добавлением 20 мг/л сернокислого стрептомицина, гриб Ph. megasperma var. medicaginis образует пышный паутинистый налет, состоящий из тесносплетенных гиф мицелия, хламидоспор и зооспор. Зооспорангии на данной среде образуются крайне редко.
На томатной агаризированной среде (200 г томатного сока, 3 г СаСО3 17 г агара на 1 л воды) штамм гриба образует разбросанный, ватообразный мицелий белого цвета, формирует хламидоспоры, половое и нередко бесполое спороношение. На жидких отварах из зерен фасоли, гороха, кукурузы, сои, а также на отварах с томатным соком штамм гриба при культивировании в течение 15-20 дней развивает обильный мицелий с немногочисленными зооспорами в виде рыхлой слизистой сероватого цвета пленки.
На всех питательных средах штамм образует несептированный мицелий, состоящий из прямых и изогнутых гиф неравного диаметра 4,0-10,1 мкм толщиной. Гифы нередко отходят под прямым углом и сужены в местах разветвлений, на гифах имеются вздутия и образования торулезного типа. Молодые растущие гифы содержат мелкозернистую цитоплазму. По мере старения гиф в них образуются вакуоли.
Для индуцирования бесполого спороношения кусочки мицелия на кукурузно-мучном агаре помещали в воду, где спустя 1-3 сут образовывались спорангиеносцы со спорангиями. Спорангиеносцы недифференцированные, чаще простые, реже симподиально разветвленные длиной 62,4-398,4 мкм. Нередко образуется пролификация спорангиеносцев путем прорастания основного ствола спорангиеносца через зооспорангий.
Зооспорангии лимоновидные, грушевидные или обратногрушевидные, размером 19.2-62.4х14.0-43.2 мкм (в среднем 48.4х28.7 мкм), без сосочка с закругленной вершиной прорастают вегетативной гифой или с образованием зооспор (от 6 до 16 и более). Зооспоры бобовидной формы 15х12 мкм с двумя жгутиками. Цисты сферические диаметром от 8.6 до 14.4 в среднем 11.5 мкм.
Половое спороношение образуется на всех питательных средах спустя 7-12 дней после культивирования штамма на средах. Зоогонии сферической формы, тонкостенные размером 26.4-37.0 мкм (в среднем 33.2 мкм). Антеридии преимущественно парагинные, реже амфигинные, по форме булавовидные или округлые, размером в среднем 16.5х10.9 мкм. Зооспоры шаровидные, размеров 26.4-33.6 мкм (в среднем 30.2 мкм) с гладкой оболочкой, толщиной 2-3 мкм.
Хламидоспоры преимущественно интеркалярные, шаровидные до лимоновидных, размером 12-25 мкм. При культивировании штамма пигментации питательных сред не отмечено.
Штамм Ph. megasperma v. medicaginis развивается в широком диапазоне температур. Оптимальной температурой для развития мицелия и образования репродуктивных спороношений является температура 22-25оС, минимальной - 5оС и максимальной - 32оС.
Физиолого-биохимические свойства. Штамм Ph. megasperma v. medicaginis успешно культивируется на искусственных природных средах, содержащих разнообразные питательные вещества. Синтетические питательные среды, включающие в качестве источника азота и фосфора неорганические соли, не благоприятны для Ph. megasperma v. medicaginis. Штамм гриба способен усваивать углерод из всех источников: из алигосахаров наиболее благоприятны для развития мицелия мальтоза, лактоза, сахароза, из моносахаров - глюкоза. Замедленный рост штамма с образованием большого количества зооспор отмечен на средах с маннитом. Лучшими источниками азота для развития мицелия и формирования зооспор являются аминокислоты аланин и лейцин, другие аминокислоты аспарагин, глютаминовая кислота и др. менее благоприятны в качестве источников азота как для развития так и образования у гриба репродуктивных спороношений. Лучший рост штамма гриба Ph. megasperma v. medicaginis отмечен при рН среды, равный 5.0-6.5. Бесполое и половое спороношение штамма усиливается при культивировании его на питательных средах и в темноте.
Пигментация среды и мицелия на всех средах не имеет места. Штамм Ph. megasperma v. medicaginis не обладает антагонистическими свойствами по отношению к различным почвенным микроорганизмам и слабо чувствителен к антибиотикам антибактериального и антигрибного спектра (стрептомицин, пенициллин, нистатин и др. ). Штамм Ph. megasperma medicaginis может длительно культивироваться на кукурузно-мучной, томатной, фасолевой, соевой агаровых средах. Для массового размножения гриба наиболее пригодны как агаровые среды так и отвары, приготовленные из томатов, зерен фасоли, гороха, сои. Мицелий и зооспоры гриба в высушенном состоянии (при температуре 50-55о) способны сохраняться в течение года без изменения вирулентности.
Патогенные свойства. Штамм Ph. megasperma var. medicaginis обладает высокой патогенностью по отношению к основному растению-хозяину - люцерне.
Сравнительное изучение патогенности штаммов возбудителей корневой гнили люцерны и в частности P. ultimum v. ultimum, P. aphanidermatum, F. oxysporum f. medicaginis (прототип) и Ph. megasperma var. medicaginis проводили в оранжерейных условиях по общепринятым методам и применительно к люцерне, а также согласно "Методическим указаниям по изучению устойчивости к болезням многолетних бобовых трав".
Инфицирование почвы указанными штаммами грибов проводили путем внесения агаровой культуры в стерилизованную почву (10 г инфекционного материала на 1 кг почвы). Патогенность учитывали по числу растений с симптомами корневой гнили и числу погибших растений. Для учета степени поражения использовали 4 балльную шкалу.
Данные, приведенные в табл. 1, свидетельствуют о исключительно высокой патогенности штамма Ph. megasperma var medicaginis на люцерне. Различия в патогенности по штаммам различных видов грибов очень контрастны. Грибы Pythium оказались слабо патогенными. Прототип, штамм F. oxysporum var. medicaginis, проявил также слабую патогенность на люцерне в сравнении с штаммом Ph. megasperma var. medicaginis. В опытах гибель люцерны в первый год жизни при инокуляции растений штаммом F. oxysporum не превышала 28-36% , тогда как штамм Ph. megasperma вызвал 100% -ную гибель растений спустя месяц после постановки опыта. Сходные результаты получены и в лабораторных опытах с инокуляцией проростков люцерны в бумажных рулонах указанными штаммами видов грибов.
П р и м е р 1. Вирулентный штамм Ph. megasperma v. medicaginis был размножен на подкисленной кукурузно-мучной агаровой среде, содержащей 17 г кукурузной муки и 20 г агара на 1 л водопроводной воды. После 15-20-дневного культивирования гриба инфекционный материал в форме мицелия и зооспор был внесен в почву из расчета 50 г/м2 и высеяны семена люцерны разных сортов (по 50 штук семян каждого сорта). Инокуляцию разных сортов люцерны штаммом F. oxysporum v. medicaginis проводили также внесением агаровой культуры в стерилизованную почву. В опыте с искусственным заражением были использованы 12 сортов люцерны, в т. ч. Токмакская местная (Киргизская ССР), Береке, Славянская местная, Ярославна, Камалинская, Казанская 36, Йыгева 118, Жидруне и др. Спустя 30 дней было отмечено массовое заражение проростков люцерны различных сортов грибом Ph. megasperma medicaginis. Гибель всходов люцерны, достигающая 91.0-100% , отмечено на сортах Йыгева 118, Казанская 36, Иолотанская, Северная, Семиреченская. Несколько слабее поражались сорта селекции Киргизского НИТИНК: Токмакская местная и Береке (табл. 2). Штамм F. oxysporum v. medicaginis во всех вариантах и сортах люцерны проявил слабую умеренную патогенность. Таким образом предлагаемый штамм Ph. megasperma v. medicaginis является наиболее эффективным для использования его в селекции люцерны на устойчивость к корневой гнили, так как создает более жесткий инфекционный фон и тем самым способствует повышению результативности работ по селекции на иммунитет.
По сравнению с прототипом предлагаемый штамм дает возможность более четкого отбора устойчивых сортов люцерны к корневой гнили в условиях, где преобладает основной возбудитель: Phytophthora megasperma. (56) Джапарова Г. А. Фузариоз люцерны в Чуйской долине Киргизии и обоснование селекции устойчивых сортов. Авт. дисс. на соиск. уч. степени канд. биол. наук. Л. 1989 г.
Использование: сельское хозяйство, защита растений, селекция растений, касается нового штамма, используемого для оценки люцерны на устойчивость к корневым гнилям. Штамм (Ш) Rhytorhthora megasperma получен путем выделения в чистую культуру из пораженных корней люцерны на посевах в Киргизстане. При изолировании Ш использована подкисленная кукурузно-мучная агаризованная среда с добавлением антибиотиков и фунгицида. Ш обладает высокой патогенностью по отношению к люцерне, что дает возможность создания жесткого инфекционного фона и четкого отбора устойчивых сортов. 2 табл.
Штамм микроскопического гриба Phytophthora megasperma Drechs. var medicaginis Kuan et Erwin ВНИИСХМ Д-47 для оценки люцерны на устойчивость к корневой гнили.
