ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12R1/125 A01N63/00 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству и может быть использовано для получения бактериального препарата против болезней сельскохозяйственных культур, вызываемых фитопатогенными грибами рода Fusarium, Microdochium, Pyrenophora, Puccinia и Phoma.

Известны штаммы Bacillus subtilis, предназначенные для защиты растений от грибных и бактериальных патогенов. Например, штаммы Bacillus subtilis В-14, используемый для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий (Патент РФ №2337955, кл. C12N, C12R, опубл. 10.11.2008), Bacillus subtilis 11 В, обладающий широким спектром антагонистической активности (Патент РФ №2182172, кл. C12N, А61К, опубл. 10.05.2002) и Bacillus subtilis M1, обладающий фунгицидной и фунгистатической активностью (Патент РФ №2307158, кл. A01N, C12N, C12R, опубл. 27.09.2007). Однако нет данных об антифунгальной активности указанных штаммов в отношении таких экономически значимых болезней как желтая пятнистость листьев (Pyrenophora tritici-repentis), снежная плесень (Microdochium nivale (F.nivale) и бурая ржавчина (Puccinia recondita f. sp. tritici). Кроме того, отсутствуют сведения о совместимости (устойчивости) этих штаммов с химическими препаратами, используемыми в системе интегрированной защиты сельскохозяйственных культур.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, являющийся основой биопрепарата «Фитоспорин» (Патент РФ №2099947, кл. A01N, C12N, C12R, опубл. 27.12.1997). Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов.

Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов, позволяющего расширить арсенал средств защиты растений от экономически значимых болезней.

Поставленная задача решается тем, что выделен штамм Bacillus subtilis BZR 336g, пригодный для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов. Новый штамм выделен из ризопланы растения озимой пшеницы Крыловского района Краснодарского края (тип почвы чернозем обыкновенный, тяжелосуглинистый, малогумусный) и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ), г. Санкт-Петербург, под номером RCAM01729. Основными критериями отбора служили подавление роста фитопатогенных грибов рода Fusarium, Microdochium, Pyrenophora, стимуляция роста растений, отсутствие фитотоксичности и патогенности к теплокровным животным. Идентифицирование штамма проводилось с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки палочковидные с закругленными концами, одиночные или соединены попарно, клетки подвижны, размеры 0,46-0,75×1,42-1,92 мкм. Имеются споры. На сухом питательном агаре для культивирования микроорганизмов форма колоний ризоидная с неправильным или лопастным краем. Колонии блестящие, бесцветные. Профиль колоний плоский, структура - мелкозернистая, консистенция мягкая, колонии прилипают к петле. Диаметр колоний 3-8 мм.

На картофельно-глюкозном агаре формируются колонии ризоидной формы с лопастным краем. Колонии матовые, кремово-желтого цвета. Профиль колоний изогнутый, структура - крупнозернистая в центре, мелкозернистая по краю, консистенция мягкая, колонии прилипают к петле. Диаметр колоний 4-9 мм.

Температурный оптимум роста +28-+35°С, оптимум рН - 6,0-8,0. В дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф). Продуцирует гидролитические ферменты группы протеаз и липаз. В качестве источника углерода активно использует мелассу, средне усваивает глюкозу, сахарозу, глицерин. Использует пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты в качестве источника азота.

Чистая культура штамма Bacillus subtilis BZR 336g хранится в пробирках на скошенной агаризированной питательной среде (картофельно-глюкозный агар или сухой питательный агар для культивирования микроорганизмов). Температура хранения +4-+8°С. Срок хранения 12 месяцев. Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (г, мл/л): панкреатический гидролизат кильки - 17,9; агар микробиологический - 11,2; NaCl - 7,7. Картофельный агар (г, мл/л): глюкоза - 20,0; агар микробиологический - 20,0; картофельный отвар (из расчета 500 г очищенного и измельченного картофеля на 1000 мл водопроводной воды) - 1000. Инкубация при температуре +28-+30°С, продолжительность выращивания - 2-3 суток.

Установлено, что штамм Bacillus subtilis BZR 336g обладает антифунгальной активностью в отношении фитопатогенных грибов из родов Fusarium, Microdochium, Pyrenophora (таблица 1).

Определение антифунгальной активности бактериальных штаммов проводили методом двойных (встречных) культур на картофельно-глюкозном агаре. В чашки Петри высевали агаровый блок с мицелием патогена, бактериальный штамм при этом наносили методом штриха на расстоянии 6 см от блока патогена. Культуры инкубировали в течение 20 дней при температуре +28°С. Контрольные варианты - чистые культуры гриба патогена и бактерии, посеянные отдельно. Учеты проводили на 5-е, 10-е, 15-е и 20-е сутки. Отмечали характер взаимоотношений гриба и бактерии: наличие или отсутствие зон, их размер, изменение цвета, плотности, толщины и направления роста мицелия патогена. Степень ингибирования роста мицелия патогена определяли по формуле

И=(1-(А/В))×100,

где И - % ингибирования;

А - рост гриба в варианте;

В - рост гриба в контроле.

Штамм Bacillus subtilis BZR 336g активно ингибировал рост следующих фитопатогенных грибов: Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Microdochium nivale (F.nivale), Pyrenophora tritici-repentis (таблица 1).

Отмечены существенные морфологические изменения патогенных грибов под воздействием вторичных метаболитов бактериального штамма Bacillus subtilis BZR 336g: отсутствие воздушного мицелия, лизис и израстание уже сформировавшегося мицелия, ингибирование роста и потемнение мицелия патогена.

Для оценки ростостимулирующей активности штамма Bacillus subtilis BZR 336g семена озимой пшеницы сорта Калым обрабатывали жидкой двухсуточной культурой. Через 24 ч обработанные семена высевали в почву в условиях открытого грунта. Повторность опыта трехкратная. Производили учет длины и массы корня и побега проростков на различных этапах вегетации. Корни проростков предварительно тщательно отмывали от почвы.

В результате предпосевной обработки семян озимой пшеницы жидкой культурой штамма бактерии Bacillus subtilis BZR 336g на ранних этапах вегетации наблюдалось статистически достоверное увеличение длины корня на 9%, массы корня на 28,0% по сравнению с проростками в контрольном варианте. На более поздних этапах вегетации было отмечено стимулирующее действие на развитие побегов: увеличение длины и массы побега на 11,3 и 51,1% соответственно.

Определение фитотоксичности штамма проводили методом замачивания семян озимой пшеницы в бактериальной суспензии. Для этого культуру штамма выращивали на картофельно-глюкозном агаре. Затем получали суспензию методом смыва стерильной водой. Семена озимой пшеницы замачивали в суспензии на два часа и ставили на проращивание в рулоны из фильтровальной бумаги. Контроль - семена, замоченные в стерильной воде. По количеству проросших семян в контроле и в варианте судили о фитотоксичности штамма.

С целью установления влияния штамма Bacillus subtilis BZR 336g на проростки озимой пшеницы в химические стаканы с бактериальной суспензией помещали проростки озимой пшеницы с подрезанной корневой системой. Контроль - проростки озимой пшеницы, помещенные в стерильную воду. Продолжительность теста 10 дней. По количеству увядших растений в контроле и вариантах судили о фитотоксичности штамма. Повторность во всех опытах трехкратная.

Из таблицы 2 видно, что заявленный штамм Bacillus subtilis BZR 336g не оказывает негативного влияния на энергию прорастания и всхожесть семян, а также не вызывает увядания проростков.

Таблица 2 Фитотоксичность штамма бактерии-антагониста Bacillus subtilis BZR 336g к культуре озимой пшеницы, сорт Батько Вариант Энергия прорастания, % Всхожесть, % Увядание проростков, % Пятнистость побега; изменение цвета корневой системы, % Контроль (стерильная вода) 90,0 92,0 0 0 Bacillus subtilis BZR 336g 90,0 94,0 0 0

Синтез антифунгальных веществ (антибиотиков, гидролитических ферментов, токсинов) - один из наиболее распространенных эффектов микробного антагонизма. Определение ферментативной активности штамма Bacillus subtilis BZR 336g бактерии-антагониста осуществляли с использованием стандартных тестов на липазу, хитиназу и протеазу.

Установлено, что штамм Bacillus subtilis BZR 336g проявляет способность к синтезу двух групп гидролитических ферментов (таблица 3).

Таблица 3 Продуцирование гидролитических ферментов штаммом Bacillus subtilis BZR 336g Ферменты протеаза липаза хитиназа ++++ +++ - Примечание: - отсутствие активности; + очень слабая активность; ++ слабая активность; +++ средняя активность; ++++ сильная активность.

Синтез хитинолитических ферментов у штамма Bacillus subtilis BZR 336g не обнаружен, но при этом выявлен активный синтез ферментов группы протеаз и липаз. Таким образом, установлено, что ингибирующее действие на фитопатогены обусловлено, в том числе действием гидролитических ферментов.

Для оценки биологической эффективности семена озимой пшеницы обрабатывали жидкой формой биопрепарата на основе штамма Bacillus subtilis BZR 336g.

Жидкую форму биопрепарата получали в колбах в системах культивирования клеток на картофельно-глюкозной среде. Культивирование осуществляли в течение 48 ч.

Для создания искусственного инфекционного фона использовали смесь прокаленного песка и инфекционного порошка (2 г порошка инокулюма на 300 г песка). Для приготовления инфекционного порошка мицелий Fusarium graminearum выращивали в колбах на стерильном зерне. Полученную смесь зерна с мицелием высушивали и измельчали до порошкообразного состояния. Инфекционный порошок тщательно перемешивали с песком и увлажняли. Полученную смесь помещали в пластиковые водонепроницаемые стаканчики и инкубировали в камере непрерывного роста растений при температуре +23-+25°С и влажности 50% в течение трех суток, после чего высевали семена озимой пшеницы сорта Батько, предварительно обработанные биопрепаратом на основе штамма Bacillus subtilis BZR 336g.

Через 16 суток после посева растения извлекали из песка, промывали корневую систему проточной водой и проводили учет пораженности корневыми гнилями, оценивали биологическую эффективность. Установлено, что в контрольном варианте развитие болезни составило 20,1%, а распространение - 75,4% (таблица 4).

Таблица 4 Биологическая эффективность штамма Bacillus subtilis BZR 336g на озимой пшенице сорта Батько на фоне искусственного заражения против Fusarium graminearum Вариант Распространение, % Развитие, % Биологическая эффективность, % Контроль (инфицированный, без обработки) 75,4 20,1 - Фитоспорин-М, Ж (Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ) -биологический эталон 41,6 13,2 40,8 Bacillus subtilis BZR 336g 23,6 5,9 71,9

Сравнение данных биологической эффективности, приведенных в таблице 4, позволяют сделать вывод, что биопрепарат на основе заявленного штамма Bacillus subtilis BZR 336g обеспечивает более высокое защитное действие по сравнению с биопрепаратом Фитоспорин на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ. Так, биологическая эффективность от применения жидкой культуры на основе Bacillus subtilis BZR 336g составила 71,9% при эффективности биологического эталона Фитоспорин 40,8%.

Установлена биологическая эффективность жидкой формы биопрепарата на основе штамма Bacillus subtilis BZR 336g против различных болезней на растениях озимой пшеницы и подсолнечника в полевых условиях (таблица 5).

Данные, приведенные в таблице 5, позволяют сделать заключение, что биопрепарат на основе заявленного штамма Bacillus subtilis BZR 336g, обеспечивает более высокое защитное действие против возбудителей бурой ржавчины и фузариозной корневой гнили пшеницы по сравнению с биопрепаратом Фитоспорин на основе штамма - прототипа Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ. Применение биопрепарата против фомоза на подсолнечнике обеспечивает также существенное защитное действие 64,4%.

Таблица 5 Биологическая эффективность обработки семян и вегетирующих растений озимой пшеницы и подсолнечника биопрепаратом на основе штамма Bacillus subtilis BZR 336g против болезней в полевых условиях Вариант Биологическая эффективность (%) против фузариозных корневых гнилей (Fusarium sp.) на пшенице сорта Батько бурой ржавчины (Puccinia recondita f. sp. tritici) на пшенице сорта Батько фомоза (Phomahelianthi) на подсолнечнике сорта Р 453 Контроль 41,7*/77,8** 20,4** 15,4** Фитоспорин-М, Ж, (Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ) -биологический эталон 40,1 10,8 - Bacillus subtilis BZR 336g 68,4 18,4 64,4 Примечание: * развитие (R, %) / ** распространение (Р, %) болезни в контроле без обработки - препарат на культуре не применялся

Доказано положительное влияние обработки семян и вегетирующих растений озимой пшеницы сорта Калым биопрепаратом на основе штамма Bacillus subtilis BZR 336g в полевых условиях на урожайность (таблица 6).

Таблица 6 Влияние обработки семян жидкой культурой на основе штамма Bacillus subtilis BZR 336g на урожайность зерна пшеницы сорта Калым и его структуру Вариант Урожайность, ц/га Дополнительный урожай Масса зерен с колоса, г Масса 1000 зерен, г ц/га %     Bacillu ssubtilis BZR 336g 50,0 16,2 48,0 1,45 36,85 контроль 33,8 - - 1,26 34,84

Данные опыта свидетельствуют о высокой эффективности штамма Bacillus subtilis BZR 336g для предпосевной обработки семян сельскохозяйственных культур, в том числе озимой пшеницы.

Определение совместимости штамма Bacillu ssubtilis BZR 336g с перспективными пестицидами (фунгицидами, инсектицидами и гербицидами) проводили, используя модифицированный метод диффузии в агар, разработанный для определения антибиотической активности микроорганизмов. Для этого в чашки Петри с картофельно-глюкозным агаром специальным стерильным сверлом вырезали в центре лунку диаметром 0,8 см, в которую закапывали 0,1 мл химического препарата в рабочей концентрации: контроль (стерильная вода), Стомп, КЭ (5,0 л/га), Прима, СЭ (0,5 л/га), Данадим, КЭ (1,0 л/га), Танрек, ВРК (0,13 л/га); Танрек, КЭ + Данадим, ВРК (1,0+0,13 л/га); Калибр, ВДГ (0,05 л/га). Каратэ Зеон, МКС (0,2 л/га). Норма расхода рабочей жидкости из расчета 300 л/га.

Бактериальные культуры высевали радиальными штрихами вокруг лунки с химическим препаратом. В контрольном варианте бактерии высевали штрихом вокруг лунки со стерильной водой. По ингибированию роста бактерий-антагонистов, изменению степени пигментирования, образованию зон задержки роста вокруг лунок судили о совместимости штамма В.subtilis BZR 336g с пестицидами. Опыт проводили в трехкратной повторности. Учеты осуществляли на вторые и седьмые сутки от начала инкубации (таблица 7).

Вирулентность штамма Bacillus subtilis BZR 336g изучали при однократном введении исследуемых штаммов внутрижелудочно белым мышам и белым крысам по 10⁷, 10⁸, 10⁹ КОЕ/мл и внутрибрюшинно мышам по 10⁵, 10⁶, 10⁸ КОЕ/мл; крысам - по 10⁷, 10⁸ и 10⁹ КОЕ/мл на животное. На каждую дозу использовали по 6 животных. Контрольной группе животных (по 6 особей) вводили физиологический раствор. Наблюдение за животными проводили в течение 30 суток.

Таблица 7 Совместимость штамма Bacillus subtilis BZR 336g с химическими препаратами Препарат Действующее вещество Норма расхода, л, кг/га Штамм В. subtilis BZR 336g Контроль стерильная вода - + гербициды Стомп, КЭ пендиметалин (330 г/л) 5,0 + Прима, СЭ 2,4-Д (сложный 2-этилгексиловый эфир) + флорасулам (300 г/л 2,4-Д к-ты + 6,25 г/л флорасулама) 0,4-0,6 + Калибр, ВДГ тифенсульфурон-метил (500) + трибенурон-метил (250 г/кг) 0,05 + инсектициды Данадим, КЭ диметоат (400 г/л) 0,8-1,2 + Танрек, ВРК имидаклоприд (200 г/л) 0,1-0,15 + Танрек, КЭ + Данадим, ВРК диметоат (400 г/л) + имидаклоприд (200 г/л) 0,8-1,2+0,1-0,15 + Каратэ Зеон, МКС лямбда-цигалотрин(50 г/л) 0,2 + «+» - штамм совместим с препаратом; «-» - штамм не совместим с препаратом.

При определении диссеминации заражение мышей проводили аналогичными способами и взвесями исследуемого штамма как при определении вирулентности. Через 30 суток после введения культур микроорганизмов животных умерщвляли. При вскрытии отмечали наличие или отсутствие внешних морфологических изменений внутренних органов, затем методом отпечатков на сухом питательном агаре для культивирования микроорганизмов проводили бактериологическое исследование внутренних органов (сердца, легких, печени, почек и селезенки).

Токсичность изучали при внутрибрюшинном введении мышам отмытых физиологическим раствором и прогретых при 70°С в течение 30 минут взвесей суточных культур исследуемых штамма Bacillus subtilis BZR 336g в дозах 10⁸ и 10⁹ КОЕ/мл на животное (по 6 особей на дозу). Срок наблюдения составил 15 суток.

Токсигенность определяли путем внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения мышам определенных объемов фильтратов трех- и семисуточной бульонной культуры исследуемого штамма Bacillus subtilis BZR 336g. Для получения фильтратов трех- и семисуточную бульонную культуру штамма предварительно центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин, а затем надосадочную жидкость фильтровали через фильтр MILLIPORE с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат трехсуточной культуры вводили по 1,0; 1,6 и 2,0 мл внутрижелудочно; внутрибрюшинно - по 0,5; 1,0 и 1,6 мл. Фильтрат семисуточной культуры - внутрижелудочно по 0,8; 1,4 и 1,8 мл; внутрибрюшинно - по 0,3; 0,8 и 1,4 мл. В случае, когда вводимый объем превышал 1,0 мл, дозу делили пополам и вводили в 2 приема с интервалом в 4 часа. На каждую дозу использовали по 6 животных. Животным контрольных групп вводили стерильную питательную среду в таких же объемах.

В результате проведенных исследований патогенности штамма Bacillus subtilis BZR 336g установлено, что штамм невирулентен для теплокровных животных, не способен к диссеминации и не вызывает бактериального поражения органов, не является токсичным и токсиногенным.

Таким образом, штамм бактерий Bacillus subtilis BZR 336g является новым, пригоден для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов и расширяет арсенал средств защиты растений от экономически значимых болезней.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bacillus subtilis, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии под номером RCAM01729 для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств защиты растений от экономически значимых болезней. 7 табл.

Штамм бактерий Bacillus subtilis, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии под номером RCAM01729 для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов.