Штамм Trichoderma asperellum F-1395 - продуцент гидролитического комплекса Российский патент 2021 года по МПК C12N1/14 A01N63/38 C12R1/645 

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, сельского хозяйства. Штамм грибка Trichoderma asperellum F-1395 может быть использован в биотехнологиях как продуцент гидролитического комплекса, обладающий целлюлазной, ксиланазной, фитотоксической, расширенной фунгицидной активностями как в лабораторных, так и в промышленных масштабах. Возможно применение в сельском хозяйстве для защиты от фитопатогенов растений и почв, для увеличения всхожести семян благодаря фитотоксической активности.

Далее в тексте заявителем приведены термины, которые необходимы для облегчения однозначного понимания сущности заявленных материалов и исключения противоречий и/или спорных трактовок при выполнении экспертизы по существу.

Продуцент гидролитического комплекса - организм (штамм грибка), способный производить гидролитический комплекс, обладающий способностью расщеплять сложные вещества до более простых, например, сахара до мономеров, белков до аминокислот и т.д.

Фунгицидная активность – ингибирующее действие ферментного комплекса на микроорганизмы-патогены, вызывающие различные заболевания у растений, за счет компонентов, присутствующих в составе заявленного продуцента гидролитического комплекса.

Целлюлазная активность - способность гидролитического комплекса расщеплять целлюлитические вещества на составляющие за счет активного действующего вещества в составе комплекса.

Ксиланазная активность - способность гидролитического комплекса расщеплять ксилан на составляющие за счет активного действующего вещества в составе комплекса.

Фитотоксическая активность - способность гидролитического комплекса улучшать всхожесть семян растений за счет активного действующего вещества в составе комплекса.

Видоспецифичность – способность одного биологического вида иметь строго определенный набор признаков/синтезировать определенный продукт в процессе жизнедеятельности данного вида.

Известна заявка на изобретение РФ № 2008108034 «Штамм гриба Trichoderma asperellum и способ его применения» от 27.08.2009 [1], сущностью является штамм Trichoderma asperellum R2, который синтезирует комплекс ферментов, применимый в производстве кормов для животных, птиц.

Недостатком является применение иного, отличного от заявленного, штамма (R2). Продукты синтеза микроскопических грибков строго видоспецифичны. А это значит, что известный штамм синтезирует другие, отличные от заявленного, продукты синтеза. Кроме того, следует отметить отсутствие фунгицидной, ксиланазной и целлюлазной активностей продуцируемого комплекса, что также является недостатком. Недостатки ограничивают область применения, вследствие чего известное изобретение невозможно применить для защиты растений от фитопатогенов.

Известна заявка на изобретение РФ № 2008108035 «Штамм гриба Trichoderma asperellum и способ его применения (варианты)» от 27.08.2009 [2], сущностью является штамм Trichoderma asperellum R1, который синтезирует комплекс летучих и нелетучих метаболитов, обладающих ингибирующим действием против фитопатогенов, повышающим иммунитет растений, урожайность и качество урожая, снижающий уровень инфекционного фона в почве, увеличивающий содержание гумуса почв, стимулирующий размножение азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Недостатком является применение иного, отличного от заявленного, штамма (R1). Также недостатком является отсутствие ксиланазной, целлюлазной активностей. Недостатки ограничивают область применения.

Известно изобретение по патенту РФ № 2696074 «Штамм мицелиального гриба Trichoderma asperellum - продуцент комплекса эндоглюканазы, ксиланазы и пектиназ для получения белковых добавок на основе зернового и зернобобового сырья для применения в кормопроизводстве» от 16.11.2018 [3]. Сущностью является штамм Trichoderma reesei ВКМ F-4789D, обладающий высокой эндоглюканазной, ксиланазной и пектиназной активностями для применения в кормопроизводстве.

Недостатком известного технического решения является отсутствие целлюлазной и фунгицидной активностей, вследствие чего ферментный комплекс не может быть применен для защиты от фитопатогенов. Недостаток ограничивает область применения заявленного изобретения.

Известно изобретение по патенту РФ № 2634415 «Штамм гриба Trichoderma asperellum для получения биопрепарата комплексного действия для растениеводства» от 26.10.2017 [4], сущностью является штамм Trichoderma asperellum OPF-19, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам.

Недостатком известного изобретения является то, что помимо применения иного штамма (OPF-19), используются споры грибка, а не его продукт. Данный недостаток говорит об отсутствии ксиланазной, целлюлазной активностей, что также ограничивает области применения.

Известно изобретение по патенту WO / 2014/089951 «Trichoderma asperellum strain GY20 and paste preparation for preventing and treating Fusarium oxysporum schl. F. Sp. Fragariae» от 29.04.2013 [5]. Сущностью является штамм Trichoderma asperellum GY20, на основе которого производится препарат в виде пасты для защиты клубники от Fusarium oxysporum.

Недостатком является ограниченная биологическая активность, проявляющаяся только в защите от одного фитопатогена (Fusarium oxysporum), а также отсутствие ксиланазной, целлюлазной активности.

Известен штамм Trichoderma reesei M18.2, подвергнутый воздействию мутагенных факторов Морозова, Ю.В «Ксиланазы Trichoderma reesei – биосинтез и применение для гидролиза зерновых кормов» [6], который при культивировании на послеспиртовой барде способен к активному синтезу ксиланаз и целлюлаз.

Послеспиртвая барда – отход спиртового производства, а значит, его наличие ограничено и зависит от многих факторов, в т.ч. экономических затрат, что существенно отличается при использовании стандартной питательной среды для культивирования микромицета. Ограниченность в получении послеспиртовой барды является недостатком известного технического решения. Помимо прочего, у известного штамма отсутствует целлюлазная активность, что ограничивает его область применения.

Наиболее близким по существу заявленного технического решения, выбранного заявителем в качестве прототипа, является штамм гриба Trichoderma asperellum F-1087 патент РФ № 2620971 «Штамм Trichoderma asperellum - продуцент гидролитических ферментов и пептидных метаболитов и его применение» от 30.05.2017 [7], который синтезирует комплекс ферментов и пептидных метаболитов, обладающих антибактериальной, противоопухолевой, фунгицидной, ферментативной активностями, применимый в биотехнологии, а также в сельском хозяйстве для подавления фитопатогенов.

Недостатками прототипа являются:

1) использование отличного от заявленного технического решения штамма Trichoderma asperellum F-1087, синтезирующий продукт, обладающий нижеприведенными недостатками;

2) синтез продуктов с ксиланазной активностью равной 8,82 МЕ/мл, что в 40 раз ниже ксиланазной активности заявленного технического решения;

3) отсутствие у прототипа фитотоксической активности, вследствие чего становится невозможным применение прототипа для обработки семян с целью улучшения их всхожести;

4) синтез продуктов с целлюлазной активностью ниже, чем в заявленном техническом решении (1,1 МЕ/мл у прототипа, против 1,37 МЕ/мл у заявленного технического решения);

5) фунгицидная активность только против двух фитопатогенов (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum).

Целью заявленного технического решения является получение штамма – продуцента гидролитического комплекса.

Техническим результатом заявленного технического решения являются:

1 - использование штамма Trichoderma asperellum F-1395, синтезирующего гидролитический комплекс;

2 - повышение ксиланазной активности;

3 - обеспечение фитотоксической активности;

4 - повышение целлюлазной активности;

5 - обеспечение расширенной фунгицидной активности.

Сущностью заявленного технического решения является штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса, обладающий целлюлазной, ксиланазной, фитотоксической, фунгицидной активностями. Штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает повышенной ксиланазной активностью, равной 335 МЕ/мл и повышенной целлюлазной активностью, равной 1,37 МЕ/мл. Штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает фитотоксической активностью для улучшения всхожести семян в сельском хозяйстве. Штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает фунгицидной активностью для борьбы с фитопатогенами растений в сельском хозяйстве.

Заявленный штамм депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ), ФГБУ ГосНИИгенетика, под регистрационным номером F-1395 25 июля 2017 года.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Примерами 1 – 4, Таблицей 1 и Таблицей 2 сопоставительного анализа.

Штамм Trichoderma asperellum F-1395 обнаружен в естественных условиях в почве республики Татарстан на территории ООО Тепличный Комбинат «Майский». Хранится в музее лаборатории сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета (сокращ. – КФУ), г. Казань и в БРЦ ВКПМ, ФГБУ ГосНИИгенетика, г. Москва.

Штамм Trichoderma asperellum F-1395 охарактеризован в научно-исследовательской лаборатории «Структурная биология», ИФМиБ, КФУ.

Штамм Trichoderma asperellum F-1395 культивируют приведенным далее способом (методом) выращивания, штамм характеризуется приведенными далее отличительными свойствами.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Колонии штамма гриба, выращенные на питательной среде Чапека, при температуре плюс 28 °С растут быстро, достигая из центра до краев чашки Петри диаметром 100 мм за 4 - 5 суток. При росте образуют до 5 концентрических колец, с интенсивным спороношением. Мицелий бесцветный, стелющийся, паутинистый. Цвет мицелия от зеленого до темно-желтого. Спороношение появляется на 4-6 сутки роста, в центральной части колонии более темные концентрические кольца по мере удаления от центра к краю. Обратная сторона колонии бесцветная или слабовато-желтая. Пигмент в питательную среду не выделяется. Экссудат обычно отсутствует. Запах слабый грибной. Гифы бесцветные, гладкие 2 - 4 мкм в диаметре, со вздутиями и толстостенными клетками. Хламидоспоры терминальные, интеркалярные, сферические или яйцевидные, бледно-зеленые, гладкие, от 4,5 до 15,0 мкм в диаметре. Спорангиеносцы бутылевидные, прямые, древовидно-разветвленные, чащу формируются в подушечках и редко в воздушном мицелии. Спорангиеносцы Спорангиеносцы симметричные и завершаются двумя или более фиалидами. Ширина спорангиеносца преимущественно от 2,8 до 4,0 мкм. Конидии имеют темно-зеленый цвет, формы от шаровидных до сферических, или яйцевидных, мелко-шиповатые, размером 3,4-3,6 на 3,0-4,0 мкм. На питательной среде PDA и SNA наблюдается бедный рост колонии.

Биохимические особенности штамма.

Отношение к источникам углерода: хорошо усваивает глюкозу, крахмал. Растет на средах, содержащих галактозу, лактозу, сахарозу, крахмал. Не усваивает целлюлозу и хитин.

Отношение к источникам азота: усваивает аммонийные формы азота и органический азот аминокислот. Восстанавливает нитраты.

Оптимальные условия и состав среды для культивирования штамма.

Штамм гриба растет в интервале значений pH от 2,5 до 9,5. Оптимальное значение pH 5,0-6,0. В более кислых условиях (pH 2,5 - 5,0) и в более щелочных (pH 7,0 - 9,5) изменяются морфологические характеристики культуры: замедлено спорообразование. Для культивирования штамма применимы плотные питательные среды: агар, сусло-агар, Чапека, SNA. Аэроб. Оптимальная температура для роста культуры гриба плюс 26 – 28 °C, длительность культивирования до массовой споруляции – от 4 до 6 суток, в зависимости от состава среды и температуры культивирования. Нетоксичен для человека, теплокровных животных, пчел и земляных червей.

Условия хранения штамма.

Штамм хранят в виде конидиальных спор на питательной среде Чапека с добавлением 10-20% - го глицерина, при температуре минус 70 °C.

Технический результат жизнедеятельности штамма гриба Trichoderma asperellum F-1395 заключается в его способности активно продуцировать гидролитический комплекс с целлюлазной, ксиланазной, фитотоксической, расширенной фунгицидной активностями. Штамм гриба Trichoderma asperellum F-1395 хорошо растет на жидкой питательной среде, при росте выделяет гидролитический комплекс с повышенной целлюлазной, повышенной ксиланазной, фитотоксической, расширенной фунгицидной активностями, что является его преимуществом в сравнении с прототипом [7].

Заявленный штамм Trichoderma asperellum F-1395 может быть использован для промышленного получения биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенов, для обработки семян и почвы перед посевом. Исследование гидролитического комплекса из культуральной жидкости штамма Trichoderma asperellum F-1395 показало, что гидролитический комплекс обладает ксиланазной активностью, равной 335 МЕ/мл; целлюлазной активностью, равной 1,37 МЕ/мл; фитотоксической активностью для улучшения всхожести семян зерновых, зернобобовых, овощных, декоративных и сорных культур; фунгицидной активностями против корневой гнили, альтернариоза, фузариоза, черной ножки, фитофтороза.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Получение штамма Trichoderma asperellum F-1395 – продуцента гидролитического комплекса.

Получают посевной материал. Для получения посевного материала культуру штамма Trichoderma asperellum F-1395 выращивают известным методом глубинного культивирования на питательной среде Чапека состава (г/л): глюкоза – 30; NaNO₃ – 3; K₂HPO₄ – 1; MgSO₄ х 7H₂О – 0,5; KCl – 0, 5; FeSO4 х 7H₂O – 0,01; агар-агар – 15; Н₂О – остальное.

Культивирование осуществляют при плюс 28 °С, в темноте, в течение 168 часов (7 суток). По истечении указанного срока с поверхности колоний дистиллированной водой смывают споры штамма грибов. Полученную суспензию разбавляют до содержания 10⁶ спор/мл и в дальнейшем используют в качестве инокулята для засева глубинных культур.

Для биосинтеза комплекса биологически активных соединений полученный инокулят засевают в стерильную природную экспериментальную среду с экстрактом ржаных пентозанов (состав, %: растворенные пентозаны - 0,2; белок - 0,5; (NH₄)₂SO₄ - 0,5), разлитую в колбы, содержащую по 100 мл среды. Культуры выращивают в течение 72-120 часов (3-5 суток) на лабораторных качалках в интенсивностью качания 200 об./мин при 28 °С при исходном значении рН - 6.0. Клетки отделяют центрифугированием. Полученные пробы исследуют, хранят и употребляют по целевым назначениям.

ПРИМЕР 2. Определение ксиланазной и целлюлазной активностей штамма Trichoderma asperellum F-1395 – продуцента гидролитического комплекса.

Получают штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса штамма Trichoderma asperellum F-1395 по примеру 1.

Определение ксиланазной и целлюлазной активностей проводят по методу Konig [8].

Приготовление образца.

Для приготовления образца 0,2-0,5 г образца взвешивают в 100 мл колбе и растворяют с перемешиванием в 100 мл натрий-ацетатного буфера (рН-6,0). Далее образцы разбавляют до конечной концентрации, то есть приблизительно до концентрации 0,2-0,7 IU/мл для ксиланаз, 0,15-0,25 IU/мл для целлюлаз. Исследования проводят в трех повторностях. Разбавленный образец в количестве 0,06 мл помещают в пробирку на 5 мин на водяную баню 40°С. Затем к нему добавляют 0,6 мл субстрата и перемешивают. Через 20 минут инкубации реакция прерывается добавлением 0,3 мл динитросалициловой кислоты (DNSA).

Приготовление субстрата для измерения ксиланазной активности.

Для приготовления субстрата 750 мг ксилана помещают в 40 мл натрий-ацетатного буфера (рН-6,0). Ксилан растворяют на водной бане при 100 °С, охлаждают до 24-26 °С, доводят рН 5,0 25%-ым НCl, объем доводят до 50 мл натрий-ацетатным буфером.

Приготовление субстрата для измерения целлюлазной активности.

Суспендируют 2 г карбоксиметилцеллюлазы (КМЦ) в 40 мл натрий-ацетатного буфера. КМЦ растворяют на водной бане при 100 °С, охлаждают до 24-26 °С, доводят рН 5,0 25%-ым НCl, объем доводят до 50 мл натрий-ацетатным буфером.

После окончания процедур по примеру 2 образцы и стандарты центрифугируют, надосадочную жидкость отбирают, затем ее инкубируют 10 мин в кипящей водной бане, охлаждают на ледяной бане 5 минут, добавляют 3 мл воды. Адсорбцию измеряют при 530 нм на спектрофотометре.

Ферментативную активность рассчитывают по формуле (1):

IU = ((PB1-PB0)*D)/20H, (1)

где:

- IU - активность фермента (МЕ-международные единицы);

- PB1 и PB0 - редуцирующие вещества после и до ферментолиза, соответственно;

- D - разбавление фермента перед внесением в реакционную смесь;

- H - дозировка препарата, мл;

- 20 - время ферментолиза, мин.

Установлено, что штамм Trichoderma asperellum F-1395 синтезирует при росте гидролитический комплекс с целлюлазной активностью, равной 1,37 МЕ/мл, ксиланазной активностью, равной 335 МЕ/мл.

ПРИМЕР 3. Определение фитотоксической активности штамма Trichoderma asperellum F-1395 – продуцента гидролитического комплекса.

Получают штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса штамма Trichoderma asperellum F-1395 по примеру 1.

Фитотоксичность оценивают на зерновых (пшеница, рожь, ячмень, кукуруза), зернобобовых (люцерна, горох, клевер), овощных (огурец, томаты, редис, кресс-салат), декоративных (гвоздики, розы) и сорных культурах (щерица, подмаренник, бодяг).

Для определения фитотоксической активности отбирают по 100 семян и замачивают в культуральной жидкости в трех разведениях 1:100, 1:10, 1:1. Через 24 часа семена раскладываю на увлажненную фильтровальную бумагу в чашке Петри.

Готовят контроль - семена, замоченные в дистиллированной воде и стерильной питательной среде.

Через 24 часа подсчитывают всхожесть семян, на 3 сутки подсчитывают энергию прорастания и длину проросток и корней. На 7 сутки измеряют длину проросток и корней, определяют сухую и сырую массу проростков и корней. Фитотоксическую активность подсчитывают по формуле (2):

Аф = 100-((Дх-Дн/Дк-Дн)*100), (2)

где:

- Аф - фитотоксическая активность ингибирования роста корней, %;

- Дх - средняя длина корней (проростков) на 7 сутки в опытном варианте, см;

- Дк - средняя длина корней (проростков) на 7 сутки в контроле, см;

- Дн - начальная длина корней (проростков), см.

Рассчитанная по формуле (2) фитотоксическая активность (способность гидролитического комплекса улучшать всхожесть семян растений за счет активного действующего вещества в составе комплекса) по сравнению с контролем представлены в Таблице 1.

Таблица 1

Фитотоксическая активность штамма Trichoderma asperellum F-1395 по сравнению с контролем

Семена тест культур Фитотоксическая активность до обработки (контроль), % Фитотоксическая активность после обработки, % Пшеница 2 5 Рожь 1,5 5 Ячмень 2,3 3 Кукуруза 1,8 4,5 Люцерна 4,2 8 Горох 1,5 6,2 Клевер 6,3 14,6 Огурец 2 3,8 Томаты 1,8 4,3 Редис 5,7 8,9 Кресс-салат 4,9 12 Гвоздика 4,8 9,4 Роза 5,6 8,5 Щерица 6,95 13 Подмаренник 1,2 4,1 Бодяг 2 3,9

Основываясь на изложенном выше, можно сделать вывод о том, что в среднем фитотоксическая активность штамма Trichoderma asperellum F-1395 способствует увеличению всхожести семян зерновых, зернобобовых, овощных, декоративных и сорных культур в 1,5 раза. Таким образом, опытным путем доказано, что штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса является достаточно эффективным средством для обработки сельскохозяйственных семян перед посевом для улучшения всхожести.

ПРИМЕР 4. Определение фунгицидной активности штамма Trichoderma asperellum F-139 – продуцента гидролитического комплекса биологически активных соединений.

Получают штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса штамма Trichoderma asperellum F-1395 по примеру 1.

Фунгицидную активность оценивают против распространенных возбудителей сельскохозяйственных растений в Поволжском регионе:

- корневой гнили (Bipolaris spp.),

- альтернариозы (Alternaria spp.),

- фузариозы (Fusarium spp.),

- черной ножки (Rhizoctonia solani),

- фитофторозы (Phytophthora spp.).

Для определения фунгицидной активности на чашку Петри, засеянную одним из фитопатогенов, помещают пропитанный гидролитическим комплексом (штамма) диск фильтровальной бумаги диаметром 7 мм.

Контроль – фильтровальный диск, пропитанный дистиллированной водой. В течение семи суток инкубации при плюс 28 °С определяют фунгицидную активность путем измерения величины диаметра d зоны подавляемости патогенных микроорганизмов.

По истечении 7 суток роста измеряют, например – линейкой, размер диаметра d зоны подавляемости.

При этом общепринято считать, что чем больше, например – в диаметре, размер зоны подавляемости роста патогенного микроорганизма – тем бόльшую фунгицидную активность оказывает заявленный штамм.

Опытным путем установлено, что заявленный штамм (с диаметром d зоны подавления) подавляет рост;

- Bipolaris spp. с d = 28 мм,

- Alternaria spp. с d = 21 мм,

- Fusarium spp. с d = 18 мм,

- Rhizoctonia solani с d = 9 мм,

- Phytophthora spp. с d = 14 мм.

Основываясь на изложенном, можно сделать вывод, что выделяемый штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса может быть достаточно эффективно использован для подавления болезней сельскохозяйственных культур.

Приведенные примеры использования предлагаемого изобретения показывают его повышенную целлюлазную и ксиланазную активности, фитотоксическую активность для улучшения всхожести семян в сельском хозяйстве, фунгицидную активность для борьбы с фитопатогенами растений в сельском хозяйстве, что доказывает его эффективность в биотехнологиях, для разработки биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенов.

Таким образом, представляется возможным констатировать достижение всех задач и технических результатов, поставленных в заявленном техническом решении, а именно;

1 - использован штамм Trichoderma asperellum F-1395 - продуцент гидролитического комплекса (см. пример 1);

2 - повышена ксиланазная активность в 40 раз - с 8,82 МЕ/мл у прототипа до 335 МЕ/мл у заявленного технического решения (см. пример 2);

3 – обеспечена фитотоксическая активность для улучшению всхожести семян зерновых, зернобобовых, овощных, декоративных и сорных культур (см. пример 3);

4 - повышена целлюлазая активность - с 1,1 МЕ/мл у прототипа до 1,37 МЕ/мл у заявленного технического решения (см. пример 2);

5- обеспечена расширенная фунгицидная активность против корневой гнили (Bipolaris spp.), альтернариозы (Alternaria spp.), фузариозы (Fusarium spp.), черной ножки (Rhizoctonia solani), фитофторозы (Phytophthora spp.) по сравнению с прототипом, который активен только против Aspergillus niger, Fusarium oxysporum (см. пример 4);

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с существенными признаками заявленного изобретения, и не установлена известность влияния существенных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», так как его можно реализовать в промышленном производстве биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенов, для увеличения всхожести семян путем обработки семян и почвы перед посевом.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. Патент РФ № 2008108034. МПК C12N 9/42 (2006.01), C12N 1/14 (2006.01), C12R 1/885 (2006.01). Штамм гриба Trichoderma asperellum и способ его применения. Опубликован: 27.08.2009.

2. Патент РФ № 2008108035. МПК A01N 63/00 (2006.01), C12N 1/14 (2006.01), C12R 1/885 (2006.01) «Штамм гриба Trichoderma asperellum и способ его применения (варианты)» Опубликован: 27.08.2009.

3. Патент RU 2696074. МПК C12N 1/14 (2006.01), C12N 9/24 (2006.01), C12R 1/885 (2006.01). Приоритет от 16.11.2018. Опубликован 30.07.2019. Описание патента: Штамм мицелиального гриба Trichoderma asperellum - продуцент комплекса эндоглюканазы, ксиланазы и пектиназ для получения белковых добавок на основе зернового и зернобобового сырья для применения в кормопроизводстве.

4. Патент РФ № 2634415. МПК C12N 1/14 (2006.01), A01N 63/04 (2006.01). Штамм гриба Trichoderma asperellum для получения биопрепарата комплексного действия для растениеводства. Опубликован: 26.10.2017.

5. Патент WO2014089951. МПК C12N 1/14 (2006.01), A01N 63/04 (2006.01), A01N 25/00 (2006.01), A01P 3/00 (2006.01). Trichoderma asperellum strain GY20 and paste preparation for preventing and treating Fusarium oxysporum schl. F. SP. Fragariae. Опубликован: 19.06.2014.

6. Ксиланазы Trichoderma reesei – биосинтез и применение для гидролиза зерновых кормов/ Ю.В. Морозова, Е.В. Скворцов, Ф.К. Алимова// Уч. Зап. Каз.Ун. серия Ест. Науки.-2013.-Т.155.-кн.2.-С. 127-137

7. Патент РФ № 2620971. МПК C12N 1/14 (2006.01), A61K 35/66 (2015.01), C12R 1/01 (2006.01). Штамм Trichoderma asperellum - продуцент гидролитических ферментов и пептидных метаболитов и его применение. Опубликован: 30.05.2017.

König J. Determination of xylanase, β-glucanase, and cellulase activity / J. König, R. Grasser, H. Pikor, K. Vogel// Anal Bioanal Chem.-2002.-V.374.- P. 80–87.

Существенный признак заявка РФ 2008108034 заявка РФ 2008108035 патент РФ 2634415 Ксиланазы Trichoderma reesei – биосинтез и применение для гидролиза зерновых кормов патент WO / 2014/089951 патент РФ
2696074 Прототип
патент РФ 2620971 Заявленное техническое
решение Используемый штамм R2 R1 OPF-19 М18.2 GY20 F-4789D F-1087 F-1395 В основе - продукт грибка + + - - + + + + В основе - сам грибок - - + + - - - - Ксиланазная активность - - - + - + +
8,82 МЕ/мл +
335 МЕ/мл Целлюлазная активность - - - + - - +
1,1 МЕ/мл +
1,37 МЕ/мл Фунгицидная активность - + + - +/-
(против одного патогена) - +
(2 вида возбудителя) +
(5 видов возбудителей) Фитотоксичес-кая активность - - + - - - - + Для защиты растений - + + - +- (только против одного патогена) - + + Для увеличения всхожести - + + - - - - + Совпадает с заявленным решением Да/нет Нет
отсутствует фунгицидная, ксиланазная, целлюлазная Нет
отсутствие ксиланазной, целлюлазной Нет
отсутствии ксиланазной, целлюлазной Нет
отсутствует целлюлазная Нет
отсутствие ксиланазной, целлюлазной активности, фунгицидная только против Fusarium oxysporum) Нет
отсутствие целлюлазной и фунгицидной Да, но отличается тем, что :
1) использован штамм Trichoderma asperellum F-1087, синтезирующий продукт, обладающий нижеприведенными недостатками;
2) синтез продуктов с ксиланазной активностью равной 8,82 МЕ/мл, что в 40 раз ниже ксиланазной активности заявленного технического решения;
3) отсутствие у прототипа фитотоксической активности, вследствие чего становится невозможным применение прототипа для обработки семян с целью улучшения их всхожести;
4) синтез продуктов с целлюлазной активностью ниже, чем в заявленном техническом решении (1,1 МЕ/мл у прототипа, против 1,37 МЕ/мл у заявленного технического решения);
5) фунгицидная активность только против двух фитопатогенов (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum). Заявленное решение имеет отличное от прототипа количество активностей

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как продуцент гидролитического комплекса, обладающий целлюлазной, ксиланазной, фитотоксической, расширенной фунгицидной активностями как в лабораторных, так и в промышленных масштабах. Штамм Trichoderma asperellum М18 депонирован в ВКПМ F-1395 и может быть использован в сельском хозяйстве для защиты от фитопатогенов растений и почв, для увеличения всхожести. Изобретение повышает урожайность сельскохозяйственных растений. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

1. Штамм Trichoderma asperellum БРЦ ВКПМ F-1395 – продуцент гидролитического комплекса, обладающего целлюлазной, ксиланазной, фитотоксической, фунгицидной активностями.

2. Штамм Trichoderma asperellum БРЦ ВКПМ F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает повышенной ксиланазной активностью, равной 335 МЕ/мл, и повышенной целлюлазной активностью, равной 1,37 МЕ/мл.

3. Штамм Trichoderma asperellum БРЦ ВКПМ F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает фитотоксической активностью для улучшения всхожести семян в сельском хозяйстве.

4. Штамм Trichoderma asperellum БРЦ ВКПМ F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает фунгицидной активностью для борьбы с фитопатогенами растений в сельском хозяйстве.