ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микобиологии и представляет собой штамм бактерии, являющийся антагонистом по отношению к яду фитопатогенных бактерий. Штамм B. subtilis депонирован в коллекции ВИЗР под N 22. Идентификацию штамма проводили по "Краткому определителю бактерий Берги", "Мир", М. 1980 г.

Химические пестициды обладают низкой эффективностью в защите от бактериозов сельскохозяйственных культур и значительной токсичностью для теплокровных животных и человека, поэтому их использование ограничено.

В настоящее время в защите от бактериозов в ограниченном объеме применяют микробиологические препараты на основе штаммов антагонистов фитолавин и фитобактериомицин.

Основной недостаток этих препаратов низкая биологическая активность и узкий спектр заболеваний. ("Список химических и биологических средств борьбы с вредителями, болезнями и сорняками и регуляторов роста растений, разрешенных для применения в сельском хозяйстве на 1986 1990 гг. "М. 1987, с. 95-96).

Наиболее близким к предлагаемому является штамм Bacillus subtilis ИМП-215, являющийся продуцентом бактофита (бацифита) препарата для защиты от мучнистой росы огурцов, вертициллезного вилта хлопчатника, корневых гнилей овощных и зерновых культур ("Проблемы создания и применения микроорганических средств защиты растений", М. 1989, с. 253, 257-295_ Недостатком указанного штамма является его недостаточно высокая эффективность против фитопатогенных бактерий.

Штамм Bacillus subtilis М-22-ВИЗР обладает высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра возбудителей бактериозов растений и является продуцентом биопрепарата гамаир. Штамм выделен из окружающей среды в г. Киеве (Украина).

Культуральные и морфологические признаки.

Штамм B. subtilis М-22-ВИЗР имеет следующие морфологические и культуральные признаки: клетки спорообразующие палочки, редко расположены в цепочки, расположение эндоспоры центральное Размеры клеток 0,8-0,9 мкм х 1,7-2 мкм. Размеры эндоспор 0,7-0,8 мкм х 1,0-1,4 мкм. По Граму окрашиваются положительно.

Для изучения культурально-морфологических свойств штамма культуру выращивали при 26±2^oC в течение 2-4 суток на твердых питательных средах следующего состава:
Мясо-пептонный агар (МПА):
мясо-пептонный бульон 800 мл
водопроводная вода 200 мл
глюкоза 10 г
агар 20 г
стерилизация при 0,5 атм 20 мин.

Сусло-агар
сусло 200 мл
вода 800 мл
агар 20 г
стерилизация при 0,8 атм 20 мин.

Кукурузно-мелассовый агар:
кукурузный экстракт 30 г
меласса 15 г
агар 20 г
вода 1 л
стерилизация при 0,8 атм 20 мин.

pH сред до стерилизации 0,8-7,2.

На агаризованных средах на 1-е сутки колонии мелкие, тускло блестящие. На 2-3 сутки роста колонии на МПА с глюкозой и кукурузно-мелассовом агаре плотные, неправильной формы, край лопастной, центр складчатый, тускло блестящий, периферия матовая. На МПА без глюкозы и сусло-агаре колонии белесоватые, сильно разрастающиеся, более источенные, центр слегка возвышен. При росте газоном на ранних стадиях роста культура белесоватая, кожистая. Затем поверхность становится бугровато-складчатой, бежеватого цвета.

Физиологические признаки: обладает каталазной активностью, гидролизует крахмал, не растет в анаэробных условиях, не обладает лецитиназной активностью, максимальная температура роста 48±2^oC, минимальная -10-12^oC. Растет на искусственных питательных средах: МПБ, МПА, СПА, поликомпонентных средах, содержащих в своем составе гидролизат рапсового шрота, дрожжи БВК и кукурузную муку в различном соотношении. Утилизирует глюкозу, маннит, крахмал. Хорошо усваивает аминокислоты, белки и их гидролизаты, гидролизаты дрожжей и т.д.

Способ биосинтеза:
А. Посевная среда:
кукурузный экстракт 3,0
меласса 1,5%
pH 6,8-7,2
Б.Ферментационная среда аналогична инокуляционной.

Культивирование проводили в глубинных условиях при температуре 26±2^oC в течение 3-х суток. Инокулюм выращивали 24 ч. Культуральную жидкость сушили лиофильно.

Способ хранения штамма: в пробирках на косяках МПА при температуре +4-6^oC или в лиофилизированном состоянии в ампулах. Частота пересева 2 раза в год, перезакладки в ампулы 1 раз в 5 лет.

Антагонистические свойства: подавляют рост фитопатогенных бактерий и грибов. Для определения антагонистической активности штамм выращивали на кукурузно-мелассовой среде в течение 3 суток при t 26±2^oC. Определяли активность культуральной жидкости, этанольного экстракта биомассы и фильтрата культуральной жидкости методом лунок. Зоны лизиса тест-культур, посеянных газоном на МПА и среде Чапека, определяли через 1-3 суток на бактериях и 3-7 сутки на грибах. (табл 1)
Пример 1. Штамм B.subtilis М-22-ВИЗР выращивали на среде, содержащей кукурузный экстракт 3% меласса 1,5% остальное водопроводная вода, pH до стерилизации 7,0 в течение 3-х суток при t 28±2^o C. Культуральную жидкость сушили лиофильно. Получили выход сухой биомассы 40 г/л с титром 3 10¹⁰ спор/г. Полученный биопрепарат (гамаир) на основе предлагаемого штамма испытали на семенах томата, искусственно зараженных возбудителем мягкой гнили овощных, в провокационных условиях влажной камеры. Для этого семена сорта Аврора замачивали в суспензии Erwinia carotovora subsp, carotovora с титром 10⁹ кл/мл в течение 2-х ч. Затем семена обрабатывали суспензией образца биопрепарата в концентрации 0,05% в течение 30 минут. Контрольные семена замачивали в воде на 2 ч. В качестве эталонов сравнения использовали биопрепараты фитолавин (0,05% ), бактофин (0,05%) и химический препарат ТМТД. Семена помещали в чашки Петри на увлажненные фильтры и инкубировали 12 дней при 25^o C. Как видно на таблице 2, обработка привела к стимуляции развития и полному подавлению загнивания проростков семян. Она была значительно более эффективной, чем в вариантах с эталоном сравнения (бактофитом и ТМТД). Фитолавин в условиях влажной камеры оказал высокую фитотоксичность, поэтому проанализировать его бактерицидный эффект в условиях не удалось вследствие загнивания проростка.

Пример 2. Биологическую эффективность препарата на основе B.subtilis М-22-ВИЗР проверяли в вегетационном опыте на растениях томата гибрида Менуэт. Рассаду в фазе 5-6 настоящих листьев опрыскивали 0,05% суспензиями биопрепаратов, а затем заражали возбудителем бактериального рака путем инъекции 0,01 мл суспензии C. miohiganense subsp. michiganense с титром 10⁹ кл/мл в пазуху листа. В течение периода вегетации наблюдали за распространенностью бактериального рака томата, учитывая увядания растений, появление пятен и усыхание листьев. Данные представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, обработка биопрепаратом гамаир на основе B. subtilus М-22-ВИЗР вдвое снижала распространенность бактериоза томата, в то время как опрыскивание бактофитом и фитолавином уменьшала этот показатель лишь в 1,2-1,7 раза.

Пример 3. Сравнительную оценку эффективности биопрепарата на основе штамма B. subtilis М-22-ВИЗР проводили в условиях мелкоделяночного опыта в производственных теплицах АО "Лето" (С.-Петербург) на посадках томата. Применение биопрепаратов начинали с замачивания семян в 0,05% суспензиях в течение 30 минут. Затем проводили 2- кратное опрыскивание растений биопрепаратами в той же концентрации в рассадный период и один раз после высадки томатов на постоянное место произрастания. В течение периода наблюдений распространенность бактериального рака по формуле:
.

где P распространенность,
n число больных растений, шт;
N общее число учтенных растений, шт.

Перед началом сбора оценивали количество плодов на одном растении (табл 4). Данные таблицы свидетельствуют, что обработка гамаиром вдвое снижала распространенность бактериального рака томата (Clavibacter michiganense subsp. michiganense), что привело к значительному усилию образования плодов.

Использование: сельскохозяйственная микробиология, касается производства средств защиты растений от фитопатогенов и касается нового штамма бактерий для производства указанных средств. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus subtilis М-22 выделен из окружающей среды. Депонирован в коллекции Всероссийского института защиты растений под N М-22, проявляет антагонистическую активность по отношению Clavibacter michiganense subsp. michiganense, Vanthomonas campestris pv. vesicatora, Pseuabmonas corrugata, Pseudamonas syringae pv. tomato, Erwinia carotovora subsp. carotovora, Alternaria splani, Verticillum dachliae, Fusarium graminearum, Ascohyta fabae, Colletotrichum lagenarium, Rhizoctonia solani, Bipolaris sorokiniana, Sclerotinia sclerotiorum, Sertoria nodorum. 4 табл.

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВИЗР М-22, используемый для защиты растений от фитопатогенных бактерий.