СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА КОЛЛАГЕНАЗЫ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/64 C12N9/48 

Изобретение относится к способам выделения ферментных препаратов и может быть применено в пищевой, медицинской и кожевенной промышленности, а также в производстве биохимических реактивов. В настоящее время известны очищенные препараты коллагеназ, выпускаемые зарубежными фирмами "Serva" и "Sigma". Эти ферментные препараты приготовлены из культуральной жидкости Clostridium hustolyticum, патогенного микроорганизма, являющегося возбудителем газовой гангрены. В связи с этим препараты дороги, и в то же время их применение в пищевой и медицинской промышленности невозможно из-за опасности микробного заражения.

Известен способ получения очищенной коллагеназы из коммерческого комплексного препарата протеолитических ферментов из гепатопанкреаса крабов Paralithodes Camtschatica [1] . По предлагаемому автоpами методу после осаждения фермента сульфатом аммония коллагеназу отделяют с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе CL 6B ("Pharmacia", Швеция) с последующим диализом и лиофилизацией. Полученный препарат очищен в 40 раз.

К недостаткам способа следует отнести его неэкономичность вследствие использования дорогостоящего импортного сорбента, а также то, что в приведенном варианте способ является аналитическим, количественный выход не указан, процесс невозможно воспроизвести в условиях масштабного производства.

Известен также способ получения коллагеназ из гепатопанкреаса камчатского краба из препарата Дигестаза [2] , включающий гель-фильтрацию на сефадексе G-75 ("Pharmacia"), ионообменную хроматографию на колонке с Моно-Q ("Pharmacia") в режиме FPLС, с последующими обессоливанием и лиофилизацией.

Способ также является аналитическим, количественный выход не указан, используются дорогие импортные сорбенты и оборудование. Степень очистки в 2-20 раз в зависимости от способа определения активности.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ получения препарата из гепатопанкреаса краба Fiddler Crab, Uca pugilator [3] путем гомогенизации сырья, осаждения комплекса ферментов сульфатом аммония и его очистки на ионообменном сорбенте. Способ включает следующие стадии: приготовление ацетонового порошка из гепатопанкреаса, центрифугирование, осаждение сульфатом аммония 70% насыщения рН 7,5 с добавлением 5 мМ CaCl₂, центрифугирование, гель-фильтрация на сефадексе G-150 ("pharmacia", Швеция), хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматография на гидроксиапатите, гель-фильтрация на сефадексе G-75, диализ с последующей лиофилизацией. Выход целевого продукта 7% . Степень очистки в 32 раза.

К недостаткам способа следует отнести использование дорогостоящих импортных реактивов и оборудования, трудоемкость процесса, многостадийность, незначительный выход целевого продукта.

Целью изобретения является упрощение и удешевление процесса, а также повышение выхода целевого продукта без уменьшения его удельной активности.

Это достигается тем, что гепатопанкреас крабов гомогенизируют, осаждают комплекс ферментов сульфатом аммония, который в отличие от прототипа подвергают очистке на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,5, элюируя коллагеназу 1 М NaCl с 15-25% изопропанола при рН 7,0-8,5, а затем фермент выделяют из элюирующего раствора при насыщении его сульфатом аммония до 60% , достигая при этом дополнительной очистки.

Предлагаемый способ является более экономичным за счет использования аминированных силикатных материалов - аминосилохромов, аминоаэросилов, амино- силикагелей, выпускаемых отечественной промышленностью, что способствует значительному удешевлению процесса очистки. Кроме того, скорость протекания растворов через сорбенты на основе макропористых силикатов на порядок выше, чем в случае сорбентов на основе сефарозы и целлюлозы.

Повышение выхода целевого продукта достигается за счет сокращения времени очистки и числа стадий, т. к. коллагеназа может при длительном процессе разрушаться протеиназами, присутствующими в ферментном растворе. Проведение ионообменной хроматографии при рН 5,2-6,4 более целесообразно, чем при рН 7,5 (прототип), т. к. коллагеназы имеют изоэлектрические точки около рН 3,0, и проведение процесса в более низком интервале рН способствует более полной сорбции фермента из раствора.

Для дополнительной очистки и концентрации фермента коллагеназу высаливают из элюирующего раствора, насыщая его сульфатом аммония до 60% . Эта операция, не снижая выхода фермента, приводит к кристаллическому продукту.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. В качестве источника коллагеназы используют гепато- панкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделяют экстракт центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения, осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 5,2-6,4 с добавлением 0,1-1,0 мМ Са²⁺. Затем наносят на макропористый кремнезем, содержащий ковалентно присоединенные алифатические аминогруппы, и промывают. Десорбцию проводят 1 М NaCl в присутствии 15-25% изопропилового спирта на буфере рН 7,0-8,5. Для усиления положительного эффекта к элюату, содержащему активный фермент, добавляют сульфат аммония до 60% насыщения. Слой, содержащий активную коллагеназу, отделяют, диализуют и лиофильно высушивают.

В результате получают очищенный ферментный препарат, обладающий коллагенолитической активностью, которую определяют известными методами. Выход 50% .

П р и м е р 1. 85 г гепатопанкреаса гомогенизируют и экстрагируют фермент буфером рН 6,4 (0,1 М ацетат аммония), затем отделяют осадок центрифугированием при 10000 об/мин, к супернатанту добавляют сульфат аммония 60% насыщения и снова центрифугируют. Полученный осадок растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4 и наносят на колонку (2,7 х 5,5 см) с аминосилохромом, уравновешенную тем же буфером. Сорбент промывают буфером. Элюцию активного фермента проводят 1 М NaCl с 25% изопропилового спирта в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0. Выход активного фермента после диализа и лиофилизации 50% . Очистка в 40 раз.

П р и м е р 2. Процесс выделения и очистки фермента производится по той же методике, как описано в примере 1. По окончании элюции к элюату добавляют сульфат аммония 60% насыщения. Всплывающий фермент отделяют центрифугированием и высушивают. Выход 50% , степень очистки в 40 раз.

Результаты проверки условий сорбции и десорбции фермента в последующих аналогичных примерах приведены в таблице.

Известно, что для сорбции на анионите необходимо проводить процесс при достаточно низком рН. Однако интервал стабильности коллагеназ лежит в области рН 5,2-9,0. Поэтому нижний предел рН сорбции необходимо поддерживать не ниже рН 5,2, целесообразно 6,4, т. к. дальнейшее повышение рН сорбции отрицательно сказывается на заряде ионообменника. Напротив, оптимальный вариант десорбции, как видно из таблицы, рН 8,0. Однако повышение рН недостаточно для полной десорбции фермента. Необходимо добавить не менее 15% изопропилового спирта, чтобы элюировать весь активный белок. В то же время увеличение концентрации спирта более 25% приводит к выпадению хлористого натрия из элюирующего раствора, что нежелательно. Поэтому оптимальными вариантами ионообменной хроматографии можно считать условия примеров 6 и 10 (таблица).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить до 50% выход целевого продукта, повысить удельную активность фермента, сократить число операций в 2 раза, повысить экономичнось способа вследствие использования дешевых реактивов и ионообменников отечественного производства. (56) 1. Сахаров И. Ю. , Литвин Ф. Е. , Артюков А. А. , Кофанова Н. Н. Биохимия, 1988, т. 53, вып. 11, с. 1844.

2. Eizen A. Z. et al. Biochemistry, 1973, v. 12, 9, p. 1814.

Использование: энзимология, пищевая промышленность, биотехнология. Коллагеназу из гепатопанкреаса крабов выделяют путем гомогенизации, отделения супернатанта центрифугированием и осаждения препарата сульфатом аммония. Затем проводят ионообменную хроматографию на аминированных силикатных материалах при рН 5,2 - 6,4, коллагеназу элюируют буферным раствором, содержащим 1 М NaCl и 15 - 25% изопропанола, рН 7,0 - 8,5. Из элюата фермент выделяют при насыщении его до 60% сульфатом аммония. Выход коллагеназы составляет 50% , очистка в 40 раз. 1 з. п. ф-лы, 1 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА КОЛЛАГЕНАЗЫ, включающий гомогенизацию гепатопанкреасы крабов, отделение экстракта центрифугированием, осаждение коллагеназы сульфатом аммония и хроматографию на ионнообменном сорбенте, отличающийся тем, что в качестве ионообменного сорбента используют аминированные силикатные материалы, при этом сорбцию коллагеназы осуществляют при рН 5,2 - 6,4, а элюцию проводят буферным раствором, содержащим I M NaCl и 15 - 25% изопропанола, рН 7,0 - 8,5. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коллагеназу выделяют из элюата путем насыщения его до 60% сульфатом аммония.