Способ очистки коллагеназы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/64 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии и используется для получения очищенной коллагеназы животного происхождения, которая находит применение в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине, в научно-исследовательской работе.

Известен способ получения коллагеназы, который заключается в выделении фермента иг гепатопанкреаса краба Ucapugllatorc помощью гомогенизации тка- „ни в 10 объемах ацетона при -20°С, обработки осадка 10 объемами н-бутанола, затем 10 объемами ацетона при -20°С, после чего проводилась сушка, растворение порошкообразного препарата центрифугирование, осаждение из раствора фермента сульфатом аммония (70% от насыщенного) при О С, гельфильтрация на сефадексе G 150, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлю- лозе, хроматография на гидроксилапатите и повторная гельфильтрация на сефадексе G 75. Все хроматографические операции

проводились при 4°С. В результате получен гомогенный препарат коллагеназы с удельной активностью 4020 единиц на мг белка.

Недостатком данного метода является его многостадийность, применение в больших количествах органических растворителей, являющихся взрывоопасными (например, ацетон, температура вспышки которого равна -18°С) и экологически грязными, а также необходимость создания низких температур на первых стадиях выделения коллагеназы.

Цель изобретения - упрощение способа получения коллагеназы краба, а также повышение его технологичности за счет изъятия из процесса взрывоопасных и экологически грязных органических соединений и повышения температуры процесса выделения фермента.

Поставленная цель достигается тем, что гепатопанкреас крабов гомогенизируют в водных растворах, центрифугированием отделяют нерастворенные вещества, добавля ют к супернатанту трет-бутиловый спирт до

Os

ю ч

СА) СЛ О

ы

его конечной концентрации 30-50% при 0- 35°С, перемешивают и добавляют сульфат аммония до его концентрации 15-20%. Образовавшийся на разделе фаз осадок растворяют в буферном растворе и после ультрафильтрации или диализа последующую очистку проводят на ДЭАЭ-сефарозе, десорбируя фермент повышением ионной силы. Все операции проводят при температуре выше 0°С. Удельная активность колла- геназы достигает 3500-4000 ед на 1 мг белка.

В предложенном способе упрощается метод очистки коллагеназы крабов за счет сокращения числа стадий процесса, а также вследствие удаления из процесса такого огнеопасного и экологически грязного реагента как ацетон. В предложенном способе отсутствует необходимость создания низких температур (-20°С) и весь процесс проводится при 0-35°С.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами,

Пример 1.26г гепатопанкреаса крабов гомогенизируют в 80 мл 50 мМ трис- HCI, рН 8,0 и центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин. К супернатанту, охлажденному до 4°С, добавляют 80 мл трет-бутило- вого спирта, а затем сульфат аммония до концентрации 20%. После полного растворения соли раствор центрифугируют при 2000 g в течение 15 мин. Образовавшийся осадок растворяют в 12 мл 50 мМ трис-HCI, рН 7,0 и удаляют сульфат аммония с помощью ультрафильтрации. Раствор коллагеназы наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой CL 6В (1.6x230 мм), уравновешенной 50 мМ трис-HCI, рН 7,0. Фермент элюируют, создавая градиент при смешении стартового буфера с тем же буфером, содержащим 1 М NaCI. Фракции, содержащие коллагеноли- тическую активность, объединяют, дианизу- ют против дистиллированной воды и лиофилизуют, Удельная активность коллагеназы равна 4000 ед. на 1 мг белка.

Пример 2. 26 г гепатопанкреаса крабов гомогенизируют в 80 мл 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0 и центрифугируют при 9000 g в течение 25 мин. К супернатанту, охлажденному до 0°С, добавляют 80 мл трет- бутилового спирта, а затем сульфат аммония до концентрации 20%. После полного растворения соли раствор центрифугируют при 8000 g в течение 5 мин Образовавшийся осадок растворяют в 12 мл 50 мМ трис- HCI, рН 7,0 и удаляют сульфат аммония диализом против того же буфера Раствор коллагеназы наносят на колонку с ДЭАЭ- сефарозой CL 6B (1,6x230 мм), уравновешенной 50 мМ трис-HCI, рН 7,0. Фермент элюируют, создавая градиент при смешении стартового буфера с тем же буфером, содержащим 1 М NaCI. Фракции, содержащие коллагенолитическую активность, объединяют, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 4000 ед. на 1 мг белка.

П р и м е р 3. 22 г гепатопанкреаса крабов гомогенизируют в 80 мл 50 мМ трис- HCI, рН 8,0 и центрифугируют при 150QO g в течение 20 мин. К супернатанту, температура которого равна 25°С, добавляют 80 мл

трет-бутилового спирта, а затем сульфат аммония до концентрации 15%. После полного растворения соли образовавшийся осадок через 30 мин фильтруют, а затем его растворяют в 12 мл 50 мМ трис-HCI, рН 7,0 и

удаляют сульфат аммония с помощью ультрафильтрации. Раствор коллагеназы наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой CL 6B (1,6x230 мм), уравновешенной 50 мМ -фис- HCI, рН 7,0. Фермент элюируют, создавая

градиент при смешении стартового буфера с тем же буфером, содержащим 1 М NaCI. Фракции, содержащие коллагенолитическую активность, объединяют, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 3900 ед. на 1 мг белка.

Пример 4. 23 г гепатопанкреаса крабов гомогенизируют в 80 мл и 50 мМ трис-HCI. рН 8,0 и центрифугируют при

10000 g в течение 20 мин. К супернатанту, нагретому до 35°С, добавляют40 мл трет-бутилового спирта, а затем сульфат аммония до концентрации 20%. После полного растворения соли раствор центрифугируют при

4000 g в течение 10 мин. Образовавшийся осадок растворяют в 12 мл 50 мМ трис-HCI, рН 7,0 и удаляют сульфат аммония с помощью ультрафильтрации. Раствор коллагеназы наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой

CL 6В (1,6x230 мм), уравновешенной 50 мМ трис-HCI, рН 7,0. Фермент элюируют, создавая градиент при смешении стартового буфера с тем же буфером, содержащим 1 М NaCI. Фракции, содержащие коллагенолитическую активность, обьединяют, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 3500 единиц на 1 мг белка

Таким образом, изобретение позволяет создать простой, легко масштабируемый и экологически чистый процесс выделения и очистки коллагеназы крабов при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья

Формула изобретенияупрощения процесса, сырье гомогенизируют в буферном растворе, экстракцию

Способ очистки коллагеназы, предус-липидов осуществляют смешиванием гоматривающий гомогенизацию гепатопанк-могената с трет-бутиловым спиртом до кореаса крабов, экстракцию липидов из5 нечной концентрации 30-50 об.% при

гомогената, осаждение сульфатом аммо-0-35°С, а осаждение фермента проводят

ния и очистку ионообменной хроматогра-сульфатом аммония, доводя его концентфией, отличающийся тем, что, с цельюрацию в растворе до 15-20 мас.%.

Изобретение относится к биотехнологии, препаративной биохимии, к очистке коллагеназы животного происхождения для клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине. Гепатопанкреас крабов гомогенизируют в водных растворах, отделяют нерастворенные вещества центрифугированием. Экстракцию липидов осуществляют добавлением к супернатанту трет-бутилово- го спирта до его конечной концентрации 30-50% при 0-35°С. Перемешивают, осаждение фермента проводят сульфатом аммония, доводя его концентрацию до 15-20%. Осадок растворяют в буфере, очищают ультрафильтрацией, диализом, хроматографией. Удельная активность коллагеназы 3500-4000 ед. на 1 мг белка.