СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА КОЛЛАГЕНАЗ С АНТИКОАГУЛЯНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КАМЧАТСКОГО КРАБА Российский патент 2010 года по МПК C12N9/64 C12N9/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных высокоактивных препаратов ингибиторов, которые могут быть использованы в биохимии, медицине, фармакологии, патофизиологии, для терапии тромбоэмболических заболеваний, а также для исследовательских целей.

Тромбозы и тромбоэмболии, связанные с закупоркой кровеносных сосудов тромбом, являются одним из наиболее распространенных и тяжелых осложнений сердечно-сосудистых заболеваний человека, приводящих к летальному исходу. Терапию тромбоэмболических заболеваний проводят введением тромболитических агентов, которые вызывают растворение внутрисосудистых сгустков. Например, различных протеолитических ферментов, которые непосредственно лизируют фибрин тромба (плазмин) или активаторы плазминогена, которые превращают эндогенный плазминоген в плазмин (урокиназа, стрептокиназа и др.).

Другой подход к решению проблемы заключается в использовании ингибиторов тромбина или активатора протромбина в качестве антикоагулянтов. Наиболее известные вещества такого действия - гирудин пиявки и гепарин. Известен способ получения аналога герудина, обладающего антикоагуляционной активностью, который получают путем трансформации штамма Е.coli., рекомбинантным вектором секреции, содержащим фрагмент ДНК, кодирующий целевой полипептид, а также последовательность точки начала репликации, полученной из плазмиды pUC. Проводят культивирование упомянутого штамма и аналог гирудина извлекают из клеток или культуральной среды. Способ очень трудоемкий, требует специального оборудования, что неизбежно приводит к удорожанию лекарственного средства.

[Патент RU №2106408, С12Т 15/12, опубл 10.03.1998]

Известны способы получения биологически активных препаратов с противосвертывающим действием из растительного сырья: растений, произрастающих в Южной Африке - Aspilia afrikana, или из растения, произрастающего в средней полосе европейской части России - таволги вязолистной (Filipendula ulmari), или из корней пиона Paeonia lutea. Биологически активные фракции экстрагируют из растительного сырья, инкубируют в термостатах и в последующем очищают гель-хроматографией. Из корней пиона продукт выделяют после измельчения и длительной сушки при 36.5-37.5°С, затем настаивают в темноте с 40%-ным этиловым спиртом из расчета на 1 г порошка 10 мл спирта, осадок отделяют, а надосадочную жидкость используют после разбавления ее водой до первоначального объема.

Получаемые по данному способу препараты или недостаточно активны, активности компонентов системы фибринолиза повышаются всего в 1,4-2 раза, или имеют побочные эффекты от использования фракций продукта, или из-за редкого ареала распространения вида растений сырье является труднодоступным.

[Патент RU, №2143270, А61К 35/78, 1999.12.27]

Известен способ получения биологически активного препарата с противосвертывающим из корней пиона Paeonia lutea. Целевой продукт выделяют из коры корней пиона, которые очищают, моют холодной водой, затем высушивают при 36.5-37.5°С в течение 23-25 ч, высушенную кору отделяют, измельчают до зернистопорошкообразного состояния, заливают 40%-ным этиловым спиртом из расчета на 1 г порошка 10 мл спирта, настаивают в темноте в течение 5-7 суток, осадок отделяют, а надосадочную жидкость доводят до первоначального объема дистиллированной водой. При пероральном введении препарата животным установлено повышение суммарной фибринолитической активности в 1.6 раза, активности активатора плазминогена в 2 раза, увеличение активированного частичного тромбопластинового времени в 1.4 раза. Получаемые по данному способу препараты недостаточно активны, активности компонентов системы фибринолиза повышаются всего в 1,4-2 раза, механизм действия неизвестен. [Патент RU, №2143270, А61К 35/78, 1999.12.27]

Наиболее близким по технической сущности является способ получения ингибитора коллагеназ из гепатопанкреаса камчатского краба, включающий гомогенизацию сырья, содержащего протеолитические ферменты, способ характеризуется проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат затем центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70% насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы дистиллированной водой 3 раза, с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием и лиофильным высушиванием.

Способ позволяет получить эндогенный ингибитор коллагенолитических ферментов из доступного сырья достаточно экономичным способом, однако получаемый препарат имеет невысокое антикоагулянтное действие.

[Патент РФ №2292393, C12N 9/64, опубл. 10.08.2007]

Все вышеизложенное позволяет сделать вывод, что поиск новых эффективных и безопасных антикоагулянтов остается до настоящего времени чрезвычайно актуальным.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента препаратов, обладающих противосвертывающим действием.

Поставленная задача решается способом получения ингибитора коллагеназ с антикоагулянтным действием из гепатопанкреаса камчатского краба, характеризующимся проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы, дистиллированной водой с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием. Полученный суммарный препарат ингибитора коллагеназы подвергают дополнительному растворению в 0,1 М ацетата аммония с рН 6,0-6,4, отделяют осадок центрифугированием и добавляют к супернатанту сульфат аммония до 35-45% насыщения, после отделения осадка последний растворяют в 0,01 М трис-буфере с рН 7,0-8,0, раствор прогревают при 70-90°С и подвергают центрифугированию, а полученную сульфат-пасту растворяют в 0,05 М трис-буфере с рН 8,0 с добавлением 0,5М NaCl и фракционируют гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с последующим концентрированием активных фракций ультрафильтрацией на мембране с размером пор 30-50 кДа, супернатант, содержащий целевой продукт, промывают и лиофильно высушивают.

Целесообразно прогревание раствора при температуре 70-90°С вести в течение 25-40 мин, а целевой продукт промывать не менее чем 5-ю объемами 0,02% раствора хлористого натрия.

Гепатопанкреас крабов, особенно камчатского краба, является источником протеолитических ферментов, в том числе и коллагеназ, способных образовывать комплексы с эндогенным ингибитором, коллагенолитические ферменты гепатопанкреаса краба относятся к особому семейству ферментов - брахиуринам. Это сериновые протеиназы, совмещающие в себе свойства трипсина и химотрипсина, поэтому ингибиторы металлопротеиназ на них не действуют. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.

Пример. 20 кг гепатопанкреаса гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,3 мМ ацетата кальция, затем осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин, к супернатанту добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения и через 20 часов снова центрифугируют. Полученный осадок (сульфат-паста) растворяют в 15 л дистиллированной с добавлением 0,1 мМ ацетата кальция воды до получения истинного раствора, объем доводят до 100 л и тщательно перемешивают. Концентрирование раствора проводят на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа. Концентрат объемом 10 л доводят дистиллированной водой до 50 л и снова концентрируют до 10 л. Эту процедуру проводят еще два раза. Супернатант, содержащий целевой продукт, прогревают при 80°С в течение 25 мин, удаляют образовавшийся осадок центрифугированием (12000g, 7 мин), а раствор высушивают на сублимационной сушке ТG-50, (Германия). Выход суммарного препарата ингибитора составляет 56 г.

600 мг суммарного препарата ингибитора растворяют в 0,1 М ацетате аммония (рН 6,4), центрифугируют при 12000-15000 g. Супернатант высаливали добавлением сульфата аммония до 35-45% насыщения и отделяют осадок центрифугированием. Далее осадок растворяют в 0,01М трис-буфере рН 7,0-8,0 и нагревают при температуре 80-85°С в течение 40 мин. С последующим центрифугировали 15 мин при 12000g. Дальнейшее выделение ингибитора проводят с помощью гель-фильтрации. Сульфат пасту растворяют в буфере (0,05 М Трис, 0,5М NaCl; рН 8,0) и наносят на колонку Sephadex G100. Активные фракции объединяют и концентрируют ультрафильтрацией на мембране, пропускающей белки с молекулярной массой 30-50 кДа, промывают 5-ю объемами 0,02% раствора хлористого натрия и высушивают лиофильно. Выход препарата - 46,4 мг.

Тестирование ингибиторной активности препарата проводили ниже указанным образом, а количество белка в пробах определяли на спектрофотометре по оптической плотности (А280) и методом "Брэдфорд".

Метод определения ингибиторной активности основан на спектрофотометрическом определении количества окрашенных продуктов реакции расщепления пептидной связи в синтетических субстратах. Коллагенолитический препарат "Морикраза", проявляет активность по хромогенному субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNa. Если ингибитор активен и образует комплекс с коллагеназой, то происходит расщепление меньшего количества молекул субстрата по сравнению с контролем. В качестве контроля проводили реакцию гидролиза субстрата "Морикразой" без добавления препарата ингибитора.

Определение ингибиторной активности определяют следующим образом: 10 мкл препарата "Морикраза" (1 мг/мл) инкубируют с 200-750 мкл раствора препарата ингибитора в течение 40 мин (при комнатной температуре). Далее добавляют 5 мкл хромогенного субстрата и доводят объем буфером (0,05 М Трис, 0,5 М NaCl) до 800 мкл. Через 30 мин инкубации в термостате (Т=37°С) реакцию останавливают 80 мкл 30% уксусной кислоты. Пробы центрифугируют при 14 тыс.оборотах в минуту (12000 g) 5 минут для осаждения непрореагировавшего ингибитора. Оптическая плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм.

Данные по изменению количества белка и ингибиторной активности на каждой стадии очистки препарата приведены в таблице 1. Из таблицы видно, что степень очистки по белку после гель-фильтрации составляет 45,5 раз по сравнению с исходным материалом (фракция №1), ингибиторная активность препарата повышается в 98 раз.

В таблице 2 представлены данные инкубации плазмы с буфером.

В таблице 3 представлены данные влияния ингибитора на экзогенный тромбин.

В таблице 4 представлены данные влияния совместного действия гепарина и ингибитора на свертывание крови.

Влияние препарата ингибитора на процесс коагуляции плазмы крови изучалось путем снятия тромбоэластограммы.

Для снятия тромбоэластограмм использовали плазму крови человека, титрованную цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9:1. Цитрат натрия связывает находящиеся в плазме ионы Са²⁺, предотвращая спонтанную коагуляцию. При добавлении к такой плазме экзогенного Са²⁺ запускается каскад системы свертывания. С другой стороны, добавляя к плазме экзогенный тромбин, запускается прямая реакция образования фибрина из фибриногена.

Тромбоэластограмма («коагуляционный профиль») - это кривая, отображающая динамику свертывания крови по изменению ее вязкости и упругоэластических свойств образующегося сгустка; характеризует процесс образования тромба, механические свойства фибрина. В целом «коагуляционный профиль» может быть качественно и количественно охарактеризован в терминах: гипо-, норма или гиперкоагуляция. Динамику образования сгустка крови регистрировали на тромбоэластографе фирмы "Hellige" (Австрия). Процесс тромбообразования в плазме крови можно запустить двумя способами - добавлением экзогенного тромбина, превращающего фибриноген в фибрин и активирующего факторы XIII, V (Ас-глобулин) и VIII (антигемофильный глобулин), или добавлением Са²⁺. Ионы Са²⁺ необходимы для придания активной конформации протромбинкиназе, участвующей в превращении протромбина в тромбин и фибриногена в фибрин. Са²⁺ также необходим для активации других факторов свертывания крови, находящихся в плазме (XIa, III, VIIa, X, IXa).²³

Влияние препарата ингибитора на процесс коагуляции плазмы крови оценивался по изменению следующих параметров, характеризующих процесс тромбообразования.

r - время реакции, соответствующее фазе активации (тромбопластино- и тромбинообразование). Измеряется от точки начала записи до начала расхождения кривых в 1 мм. Уменьшение данного параметра связано с гипертромбопластинемией.

ma - максимальная амплитуда расхождения кривых на тромбоэластограмме; характеризует максимум динамических свойств соединения фибрина и тромбоцитов посредством GPIIb/IIIa и отображает максимальную прочность сгустка. На 80% ma обусловлена количеством и свойствами (способностью к агрегации) тромбоцитов, на 20% - количеством образовавшегося фибрина.

Е - эластичность сгустка, зависит от количества тромбоцитов и концентрации фибриногена. Е=(100*ma)/(100-ma),

α - угол, построенный по касательной к тромбоэластограмме из точки начала образования сгустка. Отображает скорость роста фибриновой сети и ее структурообразование (увеличение прочности сгустка). Характеризует уровень фибриногена.

I - общий индекс коагуляции. I=160*tga. Далее, изучалось влияние совместного действия гепарина и полученного препарата ингибитора на свертывание крови.

На фиг.1 показан вид тромбоэластограммы при нормальном процессе коагуляции.

На тромбоэластограммах фиг.2 показаны контроль на буфер (сверху) и действие препарата ингибитора на процесс коагуляции без инкубации.

На тромбоэластограммах фиг.3 показано влияние препарата ингибитора на коагуляцию плазмы крови при предварительной инкубации 30 и 60 мин.

На тромбоэластограммах фиг.4 показано влияние препарата ингибитора на экзогенный тромбин. Сверху вниз: нормальное тромбообразование при добавлении в плазму крови экзогенного тромбина; влияние препарата ингибитора без предварительной инкубации; влияние препарата ингибитора с предварительной инкубацией 30 мин.

На тромбоэластограммах фиг.5 показано совместное действие препарата ингибитора и гепарина на коагуляцию плазмы крови. Сверху вниз: влияние на коагуляцию гепарина без предварительной инкубации с плазмой крови; влияние гепарина на коагуляцию с предварительной инкубацией 30 мин; совместное действие препарата ингибитора и гепарина на коагуляцию без предварительной инкубации; совместное действие препарата ингибитора и гепарина на коагуляцию с предварительной инкубацией гепарина и препарата ингибитора в течение 30 мин.

Из данных, приведенных в таблицах 2-4, и данных тромбоэластограмм, представленных на фиг.1-3, видно, что:

1. Буфер практически не влияет на тромбопластино- и тромбинообразование. Также не сказывается на максимальной амплитуде, но несколько увеличивает индекс коагуляции (на 6% по сравнению с нормой) и эластичность сгустка (на 16% по сравнению с нормой) - наблюдается очень слабая тенденция к гиперкоагуляции. Эти несильные изменения могут быть связаны с рН буфера, отличным от нормального рН крови.

2. Полученный препарат ингибитора, даже без предварительной инкубации с плазмой крови, удлиняет время тромбинообразования в 2 раза. При этом уменьшаются индекс коагуляции (на 34% по сравнению с нормой), максимальная амплитуда (на 12%), падает плотность сгустка (на 17%). Наблюдается выраженная гипокоагуляция.

3. После инкубации препарата ингибитора с плазмой крови в течение 30 минут заметно сильное ингибирование тромбинообразования, время фазы активации увеличивается на 61% по сравнению с нормой. Наблюдается замедление образования фибриновых сгустков. Еще сильнее падают значения индекса коагуляции (на 79%), максимальной амплитуды (24%) и плотности сгустка (на 32%). Очень выражена гипокоагуляция. Эта тенденция усиливается, если инкубировать плазму с препаратом ингибитора в течение 60 мин. В этих условиях время тромбинообразования падает на 72% по сравнению с нормой, индекс коагуляции уменьшается на 83%, плотность сгустка уменьшается на 39%. Гепарин, являясь антикоагулятным агентом, уменьшает плотность тромба на 35% по сравнению с нормой и общий индекс коагуляции на 51%, однако сам по себе несущественно сказывается на времени работы ферментативного каскада (время фазы тромбинообразования увеличивается на 20%) и максимальной амплитуде сгустка, которая падает на 26% по сравнению с нормой. При совместном использовании препарата ингибитора и гепарина резко увеличивается фаза активации (на 81% по сравнению с нормой) и падает максимальная амплитуда сгустка (на 82% по сравнению с нормой). Также существенно падают показатели плотности тромба (на 88%) и индекс коагуляции (на 94%). Все это говорит о сильно выраженной гипокоагуляции. При совместной инкубации плазмы, препарата ингибитора и гепарина процесс тромбообразования подавляется полностью. Более того, предложенный метод очистки легко воспроизводится и масштабируется.

Таблица 1 Стадии очистки Количество белка (мг/мл) Суммарное количество белка (мг) Ингибиторная активность на 1 мкг белка Ингибиторная активность пробы (%) Исходный белковый препарат 3,039 300 0,005 3,2% Прогретый исходный белковый препарат 1,52 152,5 0,015 4,5% Осадок после высаливания сульфатом аммония 7 63 0,03 39% Активный пик после Sephadex G100 0,6 7 0,48 58% Препарат после концентрирования на мембране 4,7 6,6 0,49 88%

Таблица 2 Условия эксперимента r Ma E I №1 5 мм 33 мм 49,3 178 Плазма - 0,25 мл         Физ. раствор - 0,05 мл         CaCl₂ - 0,06 мл         №2 6 мм 37 мм 58,7 189 Плазма - 0,25 мл         Буфер - 0,05 мл         CaCl₂ - 0,06 мл         №3 10 мм 29 мм 40,8 117 Плазма - 0,25 мл         Ингибитор 0,05 мл         CaCl₂ - 0,06 мл         №4
Инкубация плазмы с ингибитором и CaCl₂ - 0,06 мл 30 мин 13 мм 25 мм 33,3 37 №5 18 мм 23 мм 30 30 Инкубация плазмы с ингибитором и CaCl₂ - 0,06 мл 60 мин        

Таблица 3 Условия эксперимента r Ma E I №1 1 мм 15 мм 17,65 107 Плазма - 0,25 мл         Физ.раствор - 0,05 мл         Тромбин₂ - 0,06 мл         №2 1 мм 9 мм 9,9 53 Плазма - 0,25 мл         Буфер - 0,05 мл         Тромбин - 0,06 мл         №3 1 мм 4 мм 4,17 18 Плазма - 0,25 мл         Ингибитор - 0,05 мл         Тромбин - 0,06 мл         №4 5 мм 7 мм 526 23 Инкубация плазмы с ингибитором и тромбином - 0,06 мл 30 мин        

Таблица 4 Условия эксперимента r Ma E I №1 8 мм 34 мм 151,5 109,5 Плазма - 0,2 мл         Физ. раствор - 0,05 мл         CaCl₂ - 0,06 мл         Буфер - 0,05 мл         №2 10 мм 26 мм 35,1 68,6 Плазма - 0,2 мл         Буфер - 0,05 мл         Гепарин - 0,05 мл         CaCl₂ - 0,06 мл         №3 10 мм 25 мм 33,3 53,3 Плазма - 0,2 мл         Гепарин 0,05 мл         CaCl₂ - 0,06 мл         Буфер - 0,05 мл         Инкубация 30 мин         №4 11 мм 28 мм 39 69,6 Плазма - 0,2 мл         Ингибитор - 0,05 мл         Гепарин - 0,05 мл         CaCl₂ - 0,06 мл         №5 42 мм 6 мм 6,4 6,2 Инкубация плазмы с ингибитором и         гепарином - 30 мин         CaCl₂ - 0,06 мл         №6 0 0 0 0 Инкубация плазмы с ингибитором и гепарином - 60 мин         CaCl₂ - 0,06 мл        

Изобретение может быть использовано в биотехнологии. Проводят гомогенизацию сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0. Гомогенат центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения. Полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора. Затем очищают, концентрируют и обессоливают ферменты на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа. Промывают супернатант, содержащий ингибитор коллагеназы, дистиллированной водой, прогревают до 60-100°С, отделяют осадок центрифугированием. Полученный суммарный препарат ингибитора коллагеназы подвергают дополнительному растворению в 0,1 М ацетата аммония с рН 6,0-6,4, отделяют осадок центрифугированием и добавляют к супернатанту сульфат аммония 35-45% насыщения. Осадок отделяют и растворяют в 0,01 М трисовом буфере с рН 7,0-8,0. Раствор прогревают при 70-90°С, подвергают центрифугированию. Полученную сульфат-пасту растворяют в 0,05 М Трис-буфере с рН 8,0 с добавлением 0,5 М NaCl. Фракционируют гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с последующим концентрированием активных фракций ультрафильтрацией на мембране с размером пор 30-50 кДа. Супернатант, содержащий целевой продукт, промывают и лиофильно высушивают. Изобретение позволяет расширить ассортимент препаратов, обладающих противосвертывающим действием. 2 з.п. ф-лы, 5 ил, 4 табл.

1. Способ получения ингибитора коллагеназ с антикоагулянтным действием из гепатопанкреаса камчатского краба, характеризующийся проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы, дистиллированной водой с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием, полученный суммарный препарат ингибитора коллагеназы подвергают дополнительному растворению в 0,1 М ацетата аммония с рН 6,0-6,4, отделяют осадок центрифугированием и добавляют к супернатанту сульфат аммония до 35-45%-ного насыщения, после отделения осадка последний растворяют в 0,01 М трис-буфере с рН 7,0-8,0, раствор прогревают при 70-90°С, подвергают центрифугированию, а полученную сульфат-пасту растворяют в 0,05 М трис-буфере с рН 8,0 с добавлением 0,5М NaCl и фракционируют гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с последующим концентрированием активных фракций ультрафильтрацией на мембране с размером пор 30-50 кДа, супернатант, содержащий целевой продукт, промывают и лиофильно высушивают.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что прогревание раствора при температуре 70-90°С ведут в течение 25-40 мин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что целевой продукт промывают не менее чем 5 объемами 0,02%-ного раствора хлористого натрия.