Способ получения коллагеназы Советский патент 1993 года по МПК C12N9/64 

1

(61) 1343591 (21)4340904/13 (22)09.12.87 (46)07.05.93. Бюл. N 17

(71)Научно-исследовательская лаборатория биологически актионых веществ гидробион- тов МЗ СССР и Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения АН СССР

(72)И.Ю.Сахаров, Ф.Е.Ли1;вии, А.А.Артюков и Н.Н.Кофанова

(56) Авторское свидетельство СССР NJ 1343591. кл. С 12 N 9/64, 1986.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ

(57) Изобретение относится к биотехнологии, касается препаративной биотехнологии и может быть использовано для получения очищенной коллагеназы животного происхождения для применения в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине. Целью изобретения является по- ььлление удельной активности. Препарат фермента очищают осаждением сульфатом аммония (50-80% насыщения) с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-носителе. Причем сорбцию ведут при рИ . а десорбцию - добавлением в буфер 1 моль NaCi.

Изобретение относится к биотехнологии, касается препаративной биохимии и может быть использовано для получения очищенной коллагеназы животного происхождения для применения о клеточной био- технологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине, в научно-исследовательской работе и является усовершенствованием изобретения по авт.ев, № 1343591.

Целью изобретения является повышение удельной активности.

Способ заключается в следующем.

Гепатопанкреас крабоо Parallthodes camtschatica или Sriocheir Japonlca предварительно гомогенизируют в ацетоне при соотношении 1:8-12 и температуре-15-20°Сс последующей очисткой ацетоном и н-бута- нолом. Удельная активность полученного фермента составляла 93-106 единиц на 1 мг белка.

Затем проводят осаждение сульфатом аммония (50-80%) с последующей ионообменной хроматографией на носителе, содержащем диэтилзминоэгильные группировки, а сорбцию проводят при рН 5-7. Удельнля активность полученной коллагеназы достигает 3500-4000 ед./1мг белка (против 93-106 ед./мг по известному способу).

Нижняя граница рН обусловлена тем, что при рНниже 5 наблюдается б1.-1страя денатурация коллагеназы.

Верхняя граница рН обусловлена тем,что при рН 7 на ионообменниках сорбируется большое количество балластных Оелков, что резко понижает удельную акти8 носгь целевого продукта.

Нижняя граница концентрации (NH4)2SO i обусловлена тем, что при степени насыщения сульфатом аммония ниже 50% фермент осаждается неколичестаенмо.

Верхняя граница концентрации (NH4)2S04 обусловлена тем, что при степени

СО

с

ел

ю

1О

1Ю

насыщения соли више80% совместное кол- лагеназой соосаждаегся большое количество балластных белкоо,

Пример1.3г коллагеназы краба с активностью 100 ед./мг белка растворяют и 50 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 7,9. при комнатной температуре и центрифугируют при ЗООООд в течение 30 мин. Полученный осадок повторно растворяют в 35 мл того же буфера. Затем супериатанты объединяют. К полученному раствору коллагеназы при 4°С добавляют {NN4)2504 до 60% от насыщения и инкубируют в течение 1 ч, Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а затем растворяют в 10 мл 20 мм ацетатного буфера, рН 5. и дважды диализуют против того же буфера. Раствор коллагеназы наносят на колонку с ДЭАЭ-софарозой CL6B Pharmacia (9j(180 мм), уравновешенной 20 мМ ацетатным буфером, рН 5. Фермент элюируют тем же буфером, содержащим 1 моль NaCI. Фракции, содержащие коллаге- назную актиоиость, объединяют, диализуют против дистиллированной воды и лиофили- зуют. Удельная активность коллагеназы краба равна 4000 ед./мг белка.

0

П р и м е р 2. Очистку коллагеназы проводят аналогично примеру 1, однако осаждение фермента проводят 50%-ным по насыщению (N4-1)230.1, а при ионообменной хроматографии используют ДЭАЭ-сферон Chemapol, уравнооешемный 50 мМ трис- HCI, рН 7. Удельная активность полученного препарата коллагеназы 3890 ед,/мг белка.

П р и м е р 3. Очистку коллагеназы проводят аналогично примеру 1, однако осаждение фермента проводят 80%-ным по насыщению (NH4)2SO.i, а при ионообменной хроматографии используют ДЭАЭ-сферо- 5 кит ВНИИ особо чистых веществ, уравновешенный 20 мМ ацетатным буфером, рН 5. Удельная активность полученного препарата коллагеназы 3500 ед./мг белка.

Формула изобретения

Способ получения коллзгеназы по авт.св. N; 1343591, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности, очистку препарата проводят осаждением 50- 00%-ным по насыщению сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией наДЭАЭ-носителе, причем сорбцию ведут в буфере при рЫ 5-7, а десорбцию тем же буфером, содсрх зщим 1 моль NaCI.

0

5