СПОСОБ ОЦЕНКИ ДИСФУНКЦИИ ПОЛИМОРФНО-ЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, точнее к иммунологии, и предназначено для исследования функциональной активности лейкоцитов.

Изучение функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) играет важную роль в диагностике таких иммунодефицитных состояний, как часто рецидивирующие гнойно-воспалительные процессы, длительно незаживающие раны, склонность к послеоперационным осложнениям, в диагностике вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных лекарственной терапией и другими факторами. В связи с тем, что фагоциты участвуют в элиминации иммунных комплексов и активность фагоцитоза тесно связана с активностью компонентов комплемента, а именно С₃, концентрацией иммуноглобулина G, наличием других опсонизирующих факторов, исследование функциональной активности ПМЯЛ играет важную роль в оценке активности и эффективности терапии при ревматических болезнях, коллагенозах, в диагностике этих заболеваний.

Наиболее информативными критериями оценки фагоцитарной активности нейтрофилов, используемыми в качестве скринингового метода в тестах первого уровня, считается фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа и индекс бактерицидности. При снижении значений данных показателей относительно нормы судят о наличии дефекта в системе нейтрофильного фагоцитоза [1] .

Однако эти показатели характеризуют лишь поглотительную и переваривающую активность ПМЯЛ. Известно же, что нарушение фагоцитарной функции нейтрофильных фагоцитов может быть связано не только с дефектами поглотительной и переваривающей способности фагоцитов, но и с дефектами адгезии, агрегации, хемотаксиса, лизосомальной, секреторной и других функций ПМЯЛ [2, 3] .

Для точной оценки участия дисфункции ПМЯЛ в патогенезе конкретного патологического процесса и для назначения адекватной иммунокорригирующей терапии необходимо определение всего "ансамбля" функциональных характеристик ПМЯЛ. Однако решить подобную задачу может лишь иммунологическая лаборатория соответствующего уровня.

Известны способы, позволяющие оценивать различные функциональные характеристики ПМЯЛ.

Известен, в частности, способ оценки фагоцитарной активности лейкоцитов, включающий забор крови из кубитальной вены, выделение с помощью центрифугирования взвеси лейкоцитов, инкубацию ее с суточной культурой стафилококка, приготовление мазков и их окраску, подсчет фагоцитарного индекса и абсолютного фагоцитарного показателя [1] .

К недостаткам известного способа следует отнести то, что он характеризует только поглотительную и переваривающую активность фагоцитов (ПМЯЛ). Известно, что поглотительная и переваривающая функции нейтрофилов в большинстве случаев не связаны другими функциями фагоцитоза, а именно с адгезией, агрегацией, локомоторной, лизосомальной и т. д. [3] . С другой стороны, известно, что наличие гнойной инфекции может быть связано с дефектом как одной, так и нескольких функций [2] . Реальная возможность генерализации гнойной инфекции коррелирует со степенью выраженности дисфункции ПМЯЛ и соответственно требует необходимого объема терапии.

Кроме низкой информативности известного способа следует отметить его высокую трудоемкость, что связано, в частности, с необходимостью соблюдения правил работы с живыми микробными культурами. На подсчет одного мазка уходит 20 мин рабочего времени. Высокая трудоемкость способа исключает возможность его использования при массовых обследованиях, что необходимо при наблюдении за больными в условиях гнойных отделений стационаров.

Целью изобретения является повышение информативности способа при одновременном снижении его трудоемкости.

Поставленная цель достигается тем, что в способе оценки дисфункции полиморфноядерных лейкоцитов при гнойно-септической инфекции, включающем забор крови и выделение исследуемой популяции, согласно изобретению, определяют эластичность мембран клеток и по изменению (увеличению) эластичности мембран относительно нормы судят о степени дисфункции полиморфноядерных лейкоцитов при гнойно септической инфекции: при увеличении эластичности относительно нормы на 12-20% определяют нарушение поглотительной, лизосомальной, бактерицидной активности, спонтанной миграции, при увеличении эластичности мембран более чем на 20% диагностируют тотальную деактивацию ПМЯЛ.

Сопоставительный анализ заявленного и известного, выбранного за прототип, технических решений показал, что отличием предлагаемого способа является определение эластичности мембран, по степени изменения (увеличения) которой относительно нормы и оценивают дисфункцию ПМЯЛ.

Наличие отличительного от прототипа признака обеспечивает соответствие предлагаемого способа критерию "новизна".

Установлено, что при гнойно-септической инфекции имеет место иммунодефицитное состояние, проявляющееся дисфункцией ПМЯЛ и манифестируемое не только снижением реактивной способности клеток, но и нарушением "ансамбля" их функций.

Авторами впервые установлена тесная корреляционная связь между эластичностью мембран и большинством показателей функциональной активности ПМЯЛ при гнойно-септической инфекции. Как отказалось, степень угнетения функционального состояния ПМЯЛ при гнойно-септической инфекции (т. е. количество дефектных функций, степень выраженности дефекта) находятся в тесной взаимосвязи с состоянием мембранного аппарата этих клеток (диапазоном изменения эластичности мембран ПМЯЛ). Именно это и позволило использовать определение эластичности мембран для оценки (экспресс-метода) дисфункции ПМЯЛ при гнойно-септической инфекции.

Циркулирующие ПМЯЛ в условиях гнойно-септических состояний испытывают влияние большого количества экзо- и эндогенных стимулов: микробных, токсических компонентов, антибактериальных и противовоспалительных фармакологических препаратов, продуктов активации системы комплемента, кининообразования, свертывания крови, цитотоксинов и др. Несомненно, что в этих условиях не только рекогносцировочные участки, определяющие инициацию отдельных функций, но и вся цитоплазматическая мембрана фагоцитов претерпевает многочисленные конформационные изменения, что, в свою очередь, сопровождается угнетением различных показателей функциональной активности.

Оценку эластичности мембран (но красных клеток крови) осуществляют в эритрологии и гематологии для изучения деформабельности мембран клеток. Авторам не известно использование этого показателя в целях диагностики, оценки какого-либо состояния.

Существенный признак "определяют эластичность мембран и по степени изменения ее относительно нормы судят о дисфункции полиморфноядерных лейкоцитов" является новым и обеспечивает соответствие заявляемого технического решения критерию "существенные отличия".

Заявляемый способ осуществляют следующим образом:
- из венозной гепаринизированной крови больного с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколл-верографин получают фракцию ПМЯЛ (нейтрофилов);
- определяют эластичность мембран с помощью гемоцитометра, измеряют средний диаметр клеток в физиологическом растворе и максимальный диаметр клеток до их разрушения в гипотоническом растворе. Эластичность мембран рассчитывают по формуле
100 % , где А - средний диаметр клеток в физиологическом растворе; В - максимальный диаметр клеток перед разрушением в гипотоническом растворе;
- по увеличению эластичности мембран относительно нормы судят о степени дисфункции полиморфноядерных лейкоцитов при гнойно-септической инфекции: при увеличении эластичности мембран нейтрофилов относительно нормы на 12-20% определяют нарушение поглотительной, лизосомальной, бактерицидной активности, спонтанной миграции, при увеличении эластичности мембран более чем на 20% диагностируют тотальную деактивацию ПМЯЛ.

Авторами обследовано 45 больных с наличием гнойного очага и гнойно-резорбтивной лихорадки (исследованы функциональные характеристики ПМЯЛ и эластичность мембран этих клеток) и 164 донора. Результаты представлены в табл. 1. Установлено, что при гнойно-септической инфекции имеет место тесная взаимосвязь степени угнетения функционального состояния ПМЯЛ с состоянием мембранного аппарата этих клеток.

Корреляционный анализ взаимосвязи между эластичностью мембран ПМЯЛ и их функциональным состоянием в норме и при гнойно-септической инфекции выявил тесную корреляцию между эластичностью мембран и большинством показателей функциональной активности ПМЯЛ и отсутствие корреляционных взаимосвязей - при исследовании функций интактных ПМЯЛ (см. табл. 2).

Авторами установлено также, что у больных с гнойно-септическим состоянием характер дисфункции различен: у больных с признаками предшествующего иммунодефицитного состояния (частые бактериальные инфекции и т. п. ) обнаружено угнетение практически всех исследуемых функций, за исключением спонтанной хемилюминесценции, т. е. - тотальная деактивация нейтрофильных фагоцитов (ПМЯЛ) (в табл. 1 и 2 - группа 1). Эластичность мембран нейтрофилов (ПМЯЛ) в этой группе составляет 70,46 ±0,111% (превышает норму более чем на 20% ). У больных без признаков предшествующего иммунодефицитного состояния (группа II) - дефектны только поглотительная, лизосомальная, бактерицидная активность и спонтанная миграция. При этом эластичность мембран составляет 77,63±0,212% (превышает норму на 12% ). Таким образом проведенные исследования выявили зависимость между диапазоном изменения эластичности мембран ПМЯЛ и количеством дефектных функций и степенью выраженности дефекта.

Установленная авторами корреляция между эластичностью мембран нейтрофилов (ПМЯЛ) и большинством показателей функциональной активности ПМЯЛ при гнойно-септической инфекции свидетельствует об объективности предлагаемого способа оценки дисфункции ПМЯЛ и высокой информативности выбранного оценочного критерия.

Установив выраженный дефект функциональной активности ПМЯЛ у больных I группы (большые с признаками предшествующего иммунодефицитного состояния; эластичность мембран нейтрофилов - 70,46 ±0,111% ), авторы провели попытку коррекции констатированного дефекта (тотальная деактивация) с помощью сеанса экстракорпорального подключения ксено-селезенки. Данные о функциональной активности ПМЯЛ до и после сеанса перфузии крови через ксено-селезенку представлены в табл. 3.

Как видно из представленных данных, изменение эластичности мембран в сторону снижения сопровождается повышением функциональной активности ПМЯЛ и с нормализацией через 24 ч большинства показателей функциональной активности нейтрофилов (ПМЯЛ) нормализуется эластичность мембран нейтрофилов (ПМЯЛ).

П р и м е р. Больная К-ва Г. Н. , 55 лет. Поступила в гнойное отделение 12.03.90 с диагнозом: острый холецистопанкреатит. Отграниченный перитонит. Гнойно-резорбтивная лихорадка. Больной назначено консервативное лечение.

13.03.90 проведено исследование эластичности мембран нейтрофилов в соответствии с предлагаемым способом. Эластичность мембран составила 71,68% , что превышает норму. В соответствии с предлагаемым способом у больной диагностированы выраженные дефекты функциональной активности полинуклеаров, что подтвердилось при исследовании иммунограммы фагоцитов: адгезия - 39,4% , агрегация - 23,6% , лизосомальная активность - 1,23 В, бактерицидная активность 0,84 В, поглотительная активность - 2,07, спонтанная миграция - 0,55, хемотаксис на БФЕ - 1,52.

На основании полученных данных можно судить о реальной возможности развития сепсиса у больной.

Большой назначен однократный сеанс экстракорпоральной перфузии крови через ксено-селезенку.

На следующий день эластичность мембран нейтрофилов составила 88,79% , что - в соответствии с предлагаемым способом - свидетельствует о нормализации функций полинуклеаров, которая была подтверждена лабораторно: адгезия - 73,6% , агрегация - 62,3% , лизосомальная активность - 1,96 В, бактерицидная активность - 1,64 В, поглотительная активность - 2,97, спонтанная миграция - 0,8, хемотаксис на БФЕ - 2,05. Полученные характеристики функционального состояния нейтрофилов находятся в пределах нормы.

Таким образом, как видно из приведенного примера, определение эластичности мембран нейтрофилов дает объективную информацию о функциональном состоянии нейтрофилов и его изменении под действием иммунокорригирующей терапии.

Проведенные испытания предлагаемого способа подтвердили его преимущества перед способом-прототипом: в отличие от способа-прототипа, позволяющего оценивать лишь поглотительную и переваривающую активность фагоцитов, предлагаемый дает информацию об "ансамбле" функций МПЯЛ (в зависимости от диапазона изменения эластичности мембран констатируют либо нарушение поглотительной, дизосомальной, бактерицидной активности, спонтанной миграции, либо тотальную деактивацию ПМЯЛ), в зависимости же от степени констатируемой с помощью предлагаемого способа дисфункции ПМЯЛ назначают иммунокорригирующую терапию. Достижение подобного результата стало возможным благодаря установленной авторами тесной взаимосвязи эластичности мембран ПМЯЛ и выраженностью дисфункций ПМЯЛ при гнойно-септической инфекции.

Использование в предлагаемом способе высокоинформативного оценочного критерия - эластичность мембран - позволило упростить исследования: оценка дисфункции ПМЯЛ при гнойно-септической инфекции с помощью предлагаемого способа занимает 40-50 мин, при этом она автоматизирована, осуществление же способа-прототипа требует более 2 ч (2 ч 15 мин - 2 ч 20 мин), а исследование всех функциональных характеристик полинуклеаров занимает 6-7 ч.

Таким образом, эластичность мембран можно рассматривать как интегральный показатель функционального состояния клеток, пригодный для скрининга, и который можно использовать для выявления возможных дефектов клеток и степени выраженности дефекта. Оценка этого показателя позволяет дифференцированно разделить больных с наличием гнойно-резорбтивной лихорадки по степени тяжести течения инфекции и прогнозировать развитие сепсиса у больных, эластичность мембран ПМЯЛ у которых превышает норму более чем на 20% , а следовательно, вовремя назначить соответствующий необходимый объем терапии. (56) 1. Меньшиков В. В. Лабораторные методы исследования в клинике. М. : Медицина, 1987, с. 310-311.

2. Маянский А. Н. и Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск: Наука, 1989, 256 с.

3. Бережная Н. М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз. Киев: Наука думка, 1988, 188 с.

Использование: клиническая иммунология, способы исследования функциональной активности лейкоцитов. Сущность изобретения: из венозной гепаринизированной крови больного центрифугированием на двойном градиенте плотности фиколл-верографин выделяют фракцию нейтрофилов. С помощью гемоцитометра определяют эластичность мембран клеток. При увеличении эластичности на 12 - 20% относительно нормы определяют снижение функционального резерва клеток, а при его повышении более чем на 20% - тотальную дезактивацию полиморфно-ядерных лейкоцитов. Способ позволяет повысить информативность оценки функциональных нарушений полиморфно-ядерных лейкоцитов при гнойно-септической инфекции на основе регистрации одного интегрального показателя, сократить время и трудоемкость исследования. 3 табл.

СПОСОБ ОЦЕНКИ ДИСФУНКЦИИ ПОЛИМОРФНО-ЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ, включающий забор крови и выделение исследуемой популяции клеток, отличающийся тем, что определяют гемоцитометром эластичность мембран полиморфно-ядерных лейкоцитов и при значении показателя на 12 - 20% выше нормы регистрируют снижение функционального резерва клеток, а при его повышении более чем на 20% - тотальную дезактивацию полиморфно-ядерных лейкоцитов.