Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/533 

со С

Использование: в клинической практике и в научных целях для определения фагоцитарной активности нейтрофилов. Цель: повышение точности способа. Сущность изобретения: из венозной гепаринизиро- ванной крови выделяют нейтрофилы. Получают монослой адгезированных клеток, в который вносят взвесь убитой культуры золотистого стафилококка. После инкубации проводят окраску препарата акридиновым оранжевым в конечной концентрации 1:4000 - 1:5000. Затем проводят микрофлу- ориметрическое измерение интенсивности свечения отдельных нейтрофилов. При среднем значении интенсивности флуоресценции клетки свыше 3,03 констатируют повышение фагоцитарной активности, при значении меньше 2,67 - снижение Положительный эффект: сокращение времени исследования до 5-10 мин и снижение трудоемкости, точность определения повышается за счет количественен оценки результатов.

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии, и предназначено для определения нарушений фагоцитарной функции нейтрофилов.

Известен способ оценки фагоцитарной активности лейкоцитов I I I, включающий забор крови из пальца в 2%-ный раствор цитрата натрия с последующим внесением живой культуры золотистого стафилококка, инкубирование взвеси в течение 30 мин при 37°С, приготовление мазка, его фиксацию и окраску по Романовскому-Гимза, микроскопический учет, при котором определяют процент клеток, участвующих в фагоцитозе, и Количестве микробных клеток, фагоцитированных каждым лейкоцитом (оценивают не менее 100 лейкоцитов).

К недостаткам известного способа следует отнести субъективность оценки и связанную с ней низкую точность результатов, особенно в тех случаях, когда захват микробов велик и микробные клетки трудно различимы глазом в цитоплазме лейкоцитов, высокую трудоемкость способа: 20 мин рабочего времени уходит на подсчет 1 мазка. Следует отметить также утомляемость исследователя при подсчете в каждом мазке сосчитывается 100 лейкоцитов, а также число микробов, захваченных отдельными клетками. Кроме того, необходимость соблюдать правила работы с живыми микробными культурами также увеличивает трудоемкость исследования.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в способе оценки фагоцитарной активности нейтрофилов, включающем забор крови с

§

00 СЈ

4

последующим введением в нее культуры золотистого стафилококка, приготовление препарата и его окраску с дальнейшим определением поглотительной способности клеток, согласно изобретению из венозной гепариниэированной крови готовят монослой адгезированных лейкоцитов, к которому добавляют убитую культуру золотистого стафилококка, окраску препарата осуществляют акридиновым оранжевым, а оценку поглотительной способности проводят путем микрофлуориметрического измерения интенсивности красного свечения нейтро- филов и при значении интенсивности свечения одной клетки свыше 3,03, определяют повышение фагоцитарной активности, а при значении этого показателя меньше 2,67 - снижение фагоцитарной активности кле ток.

Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофияов осуществляют следующим образом.

Из венозной гепаринизированной крови выделяют путем центрифугирования слой лейкоцитов (содержащий до 60% ней- трофилов). Полученную обогащенную взвесь (концентрация «леток 2x10 кл/мл) вносят по 1 мл на среде 199 в пробирки типа сапожок с помещенными в них покровными стеклами и инкубируют в течение 1 ч при 37°С для получения монослоя адгеэирован- ных нейтрофилоа. Монослой адгезированных на покровных стеклах нейтрофилов после инкубации трижды отмывают средой 199, добавляют 0,1 мл взвеси суточной культуры золотистого стафилококка убитой нагреванием и инкубируют в течение 1 ч при 37°С.

После инкубации покровные стекла трижды отмывают средой 199 и проводят окраску монослоя раствором акридинового оранжевого в разведении 1:5000 в течение 30 с. Окрашенное таким образом покровное стекло с монослоем помещают на предметное стекло клетками вниз, удаляют фильтром избыток жидкости, на препарат наносят каплю нейфлуорисцирующей иммерсионной жидкости (диметияфталат). Затем проводят микрофлуориметрическое измерение интенсивности красного свечения отдельных нейтрофилов под лименес- центным микроскопом ЯЮМ-АМ-ИЗ со светофильтрами СС-1 и БС-8 (регистрируемое возбуждаемое свечение в пределах 600-700 нм). при этом осуществляют флуо- риметрию свечения 50 нейтрофилов, поглотивших и непоглотивших стафилококк, проводя запись результатов с помощью самописца Н-3010-1.

Определяют средний показатель свечения одного фагоцитирующего лейкоцита и при значениях его, меньших 2,67 определяют снижение фагоцитарной активности, при

значениях этого показателя превышающих 3,03 - усиление ее.

Пример 1. Донор А. Готовят монослой лейкоцитов на покровном стекле путем инкубации лейковзвеси при 37°С в течение 1

ч. К монослою добавили 0,1 мл убитой суточной культуры золотистого стафилококка в концентрации 2 млрд в 1 мл и инкубировали в термостате еще в течение 1 ч. Стекло трижды отмывали средой 199 и прокрашивали

раствором акридинового оранжевого (в разведении 1:5000) в течение 30 с. Монослой клеток вновь отмывали средой 199, поместили на предметное стекло клетками вниз, удаляя избыток влаги фильтровальной бумагой.

Затем осуществляли микроскопирова- ние, проводя флуориметрию свечения фагоцитирующих и нефагоцитирующих фоновых лейкоцитов в количестве 50 штук и записыаая результат с помощью самописца Н- 3010-1. Графическую запись результата оценивали путем измерения высоты зубцов в 50 клетках, определили среднюю интенсивность свечения 1 лейкоцита.

Значение фагоцитарной активности у обследуемого донора А составило 2,9 в. В соответствии с предлагаемым способом это свидетельствует о нормальной фагоцитарной активности лейкоцитов у донора А.

П р и м е р 2. Больной Н. Диагноз: стафилококковая инфекция, эмпиема легких. При оценке фагоцитарной активности с помощью способа-прототипа у больного обнаружено, что стадия захвата объектов фагоцитоза настолько велика, что сосчитать глазом количество захваченных стафилококков не представляется возможным.

Фагоцитарную активность в предлагаемом способе оценивали в соответствии с

предложенной схемой: сняли показатель свечения в с 50 профагоцитировавших и не- профагоцитировавших клеток нашли среднее значение свечения 1 клетки - оно составило 4,0 в. В соответствии с предлагаемым способом (так как показатель нормального свечения составляет 2,85 i 0,18) сделан вывод о резком повышении фагоцитарной активности лейкоцитов у данного больного.

Проведенные испытания способа подтвердили такие преимущества перед известным способом как повышение объективности, что достигнуто благодаря переходу от полуколичественной еизуальной оценки к количественной микрофлуори- метрической.

Сокращение времени исследования: в известном способе на подсчет 1 мазка уходит 20 мин рабочего времени, в предлагав- мом способе - в среднем от 5 до 10 мин, что связано, в частности, с возможностью проведения оценки реакции в меньшем количестве лейкоцитов: не в 100 клетках (как в известном способе), а в 50.

Важным преимуществом является улучшение условий труда исследователя, использование убитой культуры золотистого стафилококка обеспечило его безопасность, снизилась трудоемкость способа за счет ис- ключения необходимости соблюдения правил работы с живыми микробными культурами, уменьшилась утомляемость исследователя за счет перехода от визуальной оценки к автоматизированной (утомляе- мость известного способа обусловлена, в частности, тем, что в соответствии с ним необходим подсчет числа объектов фагоцитоза в каждой из 100 клеток).

Предлагаемый способ может быть ис- пользован с целью оценки фагоцитарной активности лейкоцитов для научных целей, а также в клинической практике. В связи с тем. что при гнойно-воспалительных и инфекционных заболеваниях в подавляющем

большинстве случаев наблюдается повышение фагоцитарной реакции лейкоцитов, необходимо отметить особую значимость предлагаемого способа при повышении активности фагоцитоза. Способ необходим в клинической иммунологии как для постановки диагноза, так и для назначения имму- нокорригирующей терапии.

Формул а изобретен и я Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов при гнойно-септических состояниях, включающий забор крови, введение в нее культуры золотистого стафилококка, приготовление препарата и его окраску с последующим определением поглотительной способности нейтрофилов, отличающийся тем. что. с целью повышения точности способа, проводят забор венозной крови и убитую культуру золотистого стафилококка вводят в монослой адгезированных нейтрофилов, окраску препарата осуществляют акридиновым оранжевым в конечной концентрации 1:4000 - 5000 и оценку поглотительной способности проводят микрофлуориметрически, при этом при среднем значении интенсивности флуоресценции одной клетки свыше 3,03 констатируют повышение фагоцитарной активности, при значении меньше 2.67 - снижение.