СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ФУНКЦИИ ФАГОЦИТОВ ПРИ РАЗВИТИИ РЕЦИДИВИРУЮЩИХ ИНФЕКЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии, микробиологии, фармакологии, клинической фармакологии и может использоваться для мониторинга состояния клеточного иммунитета при иммунодефицитных состояниях.

Известен способ выявления хронических и рецидивирующих бактериальных инфекций путем диагностики нарушения хемотаксической функции фагоцитов, описанный в книге Knutsen A.P., Fischer T.J. Первичные иммунодефициты: лабораторные исследования, 1995 г. Способ исследования фагоцитов используется, если исследование гуморального и клеточного иммунитета не выявило отклонений от нормы. Недостаточность фагоцитов может быть обусловлена нарушением их миграции, хемотаксиса, адгезии фагоцитов, а также нарушением собственно фагоцитоза, дефицитом опсонинов и нарушением метаболизма фагоцитов, (хемотаксис - направленное движение фагоцитов против градиента концентрации).

Известный способ заключается в следующем.

Лейкоциты, выделенные из крови больного, отмывают от сыворотки, подсчитывают и помещают в среду, содержащую сыворотку здорового или больного (источник опсонинов) и живые бактерии. Смесь инкубируют при 37°С, отбирая пробы через 0, 30, 60, 120 мин после начала инкубации. Для определения числа жизнеспособных бактерий каждую пробу быстро охлаждают и делают посев. Через 2 часа после начала инкубации смесь центрифугируют. Лейкоциты и фагоцитированные бактерии оседают на дно, а нефагоцитированные бактерии остаются в надосадочной жидкости. В осадке и надосадочной жидкости определяют число жизнеспособных бактерий. Исследуют хемотаксис лейкоцитов in vitro на основе стимуляции выделенных из крови фагоцитов факторами хемотаксиса. Способность фагоцитов к направленной миграции оценивают, поместив их в чашку Петри с агарозой или в камеру Бойдена. Определяют адгезию лейкоцитов, проверяя отсутствие CD11/CD18 на нейтрофилах и моноцитах с помощью проточной цитофлюориметрии. Затем оценивают результаты проведенных исследований. Повышенное содержание жизнеспособных бактерий в надосадочной жидкости при инкубации с сывороткой свидетельствует о дефиците опсонинов, нарушение хемотаксиса лейкоцитов может быть обусловлено дефектом фагоцитов, наличием ингибиторов хемотаксиса, дефицитом сывороточных или тканевых факторов хемотаксиса, нарушение адгезии лейкоцитов обусловлено снижением экспрессии или отсутствием на их поверхности молекул адгезии и может рецидивироваться бактериальными инфекциями или пародонтитом.

Недостатком известного способа является не вполне удовлетворительная точность диагностики.

Известен способ определения вида бактериальной инфекции, описанный в одноименном а.с. СССР № 1156644 по кл. А61В 10/00, з. 10.12.82, оп. 23.05.85.

Известный способ заключается в том, что выделяют бактериальные клетки из патологического материала больных, осаждают эритроциты, готовят агарозный гель, дополнительно из крови того же больного выделяют гранулоциты и с помощью агарозного геля исследуют их хемотаксическую активность по отношению к выделенным живым бактериям и при индексе хемотаксиса меньше одной условной единицы определяют вид бактериальной инфекции.

Недостатком известного способа является его не вполне удовлетворительная точность диагностики.

Известен способ определения ферментативной активности фагоцитов, описанный в статье Демидова А.А. и др. Ферментная активность нейтрофилов и моноцитов крови больных сахарным диабетом. - В журнале «Сахарный диабет», 2001 г., № 3 и выбранный в качестве прототипа.

В известном способе получают моноциты по методу И.С.Фрейдлина, определяют эстеразную активность методом азосочетания по М.Nachlas и А.Seligman в модификации G.Gomori. И подсчитывают продукт реакции в световом микроскопе под иммерсионным увеличением i1350 полуколичественным методом Kaplow с подсчетом среднего цитохимического показателя (СЦП) по формуле: СЦП=а+2б+3в усл. Ед.

Известный способ также не обеспечивает высокой точности, поскольку использует абсолютные значения замеров и расчетов, влияющие на характеристики нарушений функций. Кроме того, этот способ является менее полным, чем заявляемый, поскольку не учитывает функциональной активности фагоцитов.

Задачей заявляемого способа является повышение точности диагностики. Поставленная задача решается тем, что в способе выявления нарушения функции фагоцитов при развитии хронических рецидивирующих инфекционных процессов, заключающемся в том, что выделяют из крови больного лейкоциты, отмывают их от сыворотки, оценивают ферментативную активность фагоцитов, определяют активность эстераз и средний цитохимический показатель, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ дополнительно оценивают функциональную активность фагоцитов на фиксированных клетках, включая определение рецепторов клеток, с помощью набора моноклональных и поликлональных антител методом иммунофлюоресценции с использованием поствитального окрашивания, исследуют in vitro хемотаксис фагоцитов, стимулируя их факторами хемотаксиса и оценивая способность фагоцитов к направленной миграции, поместив их в чашку Петри с агарозой, определяют индекс хемотаксиса и вычисляют дополнительно индекс экспрессии, индекс активности эстераз и индекс суммарного цитохимического коэффициента, затем оценивают результаты исследований по величине индекса хемотаксиса и делают выводы о наличии дефекта функции фагоцитов при величине индекса хемотаксиса меньше 1 условной единицы и виде инфекции, а при величине индекса экспрессии, индекса активности эстераз и индекса суммарного цитохимического коэффициента меньше 1 условной единицы делают выводы о нарушении рецепции и ферментативной активности фагоцитов.

В заявляемом способе оценка активности ферментов проводится в процессе хемотаксиса фагоцитов, т.е. на модели движения фагоцитов в очаг активного воспаления. Хемотаксис является начальным звеном ответа фагоцита на альтерацию и воспаление. Предлагаемый способ позволяет охарактеризовать функциональную активность фагоцитов в очаге воспаления, включая определение рецепторов клеток, с помощью набора моноклональных и поликлональных антител методом иммунофлюоресценции с использованием поствитального окрашивания, что в совокупности с вычислением дополнительно индекса экспрессии, индекса активности эстераз и индекса суммарного цитохимического коэффициента, при величине которых меньше 1 условной единицы делают вывод о нарушении рецепции и ферментативной активности фагоцитов, обеспечивает, помимо суммарной оценки способности фагоцитов к направленной локомоции, выделение различных элементов нарушения этой функции, таких как дефекты рецепции, метаболической активности, передачи хемотаксического сигнала, и оценку механизма повреждения направленной двигательной активности фагоцитов, давая возможность получить новые, неизвестные ранее данные о функциях фагоцитов и их нарушениях, которые невозможно получить существующими методами, и позволяя проводить далее целенаправленную коррекцию функций фагоцитов в зависимости от выявленных нарушений, обеспечивая, таким образом, высококачественную диагностику и последующее эффективное лечение.

Технический результат - более высокая детализация элементов нарушения функции фагоцитов, позволяющая более точно дифференцировать вид нарушения.

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него наличием таких существенных признаков, как определение индексов показателей ферментативной активности фагоцитов, дополнительная оценка функциональной активности, включая определение рецепторов клеток, с вычислением дополнительных индексов активности при использовании для оценки набора моно- и поликлональных антител методом иммунофлюоресценции, и вычисление индекса хемотаксиса, позволяющих при величине всех индексов меньше условной единицы детализировать нарушения функций фагоцитов, обеспечивающих в совокупности повышение точности диагностики, т.е. достижение заданного результата.

Заявителю неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может найти широкое применение в аллергологии, иммунологии, микробиологии, фармакологии, клинической фармакологии, а потому соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ выявления нарушения функции фагоцитов при развитии хронических инфекционных процессов заключается в следующем.

Выделяют из крови больного лейкоциты, отмывают их от сыворотки, исследуют in vitro хемотаксис фагоцитов. Для этого их стимулируют факторами хемотаксиса и оценивают способность фагоцитов к направленной миграции, поместив их в чашку Петри с агарозой, оценивают результаты исследований по величине индекса хемотаксиса. Дополнительно оценивают ферментативную активность фагоцитов, а также функциональную активность фагоцитов, включая определение рецепторов клеток, с помощью набора моноклональных и поликлональных антител методом иммунофлюоресценции с использованием поствитального окрашивания. При исследовании вычисляют индекс хемотаксиса, индекс экспрессии, индекс активности эстераз и индекс суммарного цитохимического коэффициента. Затем оценивают результаты исследований и по величине перечисленных индексов делают выводы о наличии определенного дефекта функции фагоцитов при величине индекса меньше 1 условной единицы.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

В силиконированную или пластиковую пробирку, содержащую 250 ЕД гепарина и 1,0 мл 6% раствора декстрана Т-500, забирают 10 мл венозной крови пациента и тщательно перемешивают. Осаждение эритроцитов осуществляют в течение 60 минут при температуре 37°С. В период осаждения готовят агарозный гель.

Приготовленный агарозный гель разливают в пластиковые чашки Петри для однократного использования диаметром 40 мм, на дне которых расположены покровные стекла размером 24×24 мм. Объем агарозного геля на одну чашку составляет 3,0 мл. Для формирования лунок в агарозном геле применяется стандартный штамп, представляющий собой металлический (латунный) диск диаметром 40 мм и высотой 15 мм, на нижней поверхности которого располагаются 9 полых латунных стержней с наружным диаметром 2,4 мм. Стержни располагаются по строго перпендикулярно перекрещивающимся линиям. При этом один из стержней находится в точке перекрещивания линий, а остальные стержни попарно располагаются на этих линиях. Расстояние между стержнями 2,4 мм. Высота стержней должна быть строго одинакова и не менее 1 см.

После приготовления чашек с агарозным гелем их помещают в среду с углекислым газом до появления оранжевого окрашивания геля. По окончании этой манипуляции агарозный гель считается готовым для проведения хемотаксиса фагоцитов под агарозой.

Для получения взвеси фагоцитов крови плазму после осаждения эритроцитов осторожно отбирают и наслаивают на двойной градиент плотности фиколл-урографина. Плотность нижнего градиента составляет 1,095, а верхнего - 1,077. После центрифугирования при 1500 об/мин (400 g) в течение 40 мин слой плазмы удаляют, верхнее кольцо отбирают для оценки хемотаксиса моноцитов, а нижнее - для оценки хемотаксиса гранулоцитов. Взвеси лейкоцитов трижды промывают в растворе Хенкса. Отмытые лейкоциты разводят в среде 199 до концентрации 10⁶ гранулоцитов/мл и 10⁸ мононуклеарных лейкоцитов/мл.

При изучении активности фагоцитов в эксперименте на мышах нейтрофилы получают из брюшной полости следующим образом. В брюшную полость мыши вводят 2 мл стерильного сахарного бульона и на следующий день забирают клетки перитонеального экссудата для оценки хемотаксической активности нейтрофилов или на третий день - для оценки хемотаксической активности моноцитов. Взвеси лейкоцитов трижды промывают в растворе Хенкса. Отмытые лейкоциты разводят в среде 199 до концентрации 10⁶ гранулоцитов/мл и 10⁸ мононуклеарных лейкоцитов/мл.

В качестве хемоаттрактантов можно применять:

1) взвеси суточных культур бактерий в концентрации 10⁸ бактерий/мл, выращенных на питательном агаре. Взвесь бактерий получают путем смыва стерильной средой 199. Концентрация бактерий определяется по стандарту мутности;

2) лекарственные препараты;

3) аллергены;

4) цитокины;

5) С5а-фрагмент комплемента и другие биологически активные субстанции.

После приготовления всех компонентов (чашек с агарозным гелем, взвесей лейкоцитов, хемоаттрактантов) в центральную лунку вносят 0,01 мл среды 199. В средние лунки помещают по 0,01 мл взвеси лейкоцитов, а в крайние - по 0,01 мл тестируемых хемоаттрактантов. Таким образом, можно одновременно оценивать хемотаксис к четырем хемоаттрактантам на одной чашке с агарозным гелем. Завершив внесение тестируемых соединений, чашки выдерживают в среде с углекислым газом при температуре 37°С в течение 3 часов при изучении хемотаксиса гранулоцитов человека, 4-6 часов при изучении хемотаксиса гранулоцитов мыши, 18 часов при изучении хемотаксиса моноцитов. По окончании этого срока для фиксации клеток к стеклу в чашки заливают 1,5 мл 47% раствора формалина и выдерживают 30 мин. По окончании фиксации агарозный гель удаляют, а стекла промывают в проточной воде.

Учет хемотаксиса производят при световой микроскопии в рассеянном свете при увеличении ×70 с помощью окулярного микрометра. Для этого измеряют две хоны миграции клеток: в сторону хемоаттрактанта (А) и от хемоаттрактанта в сторону среды 199 (В). Индекс хемотаксиса вычисляется по формуле:

ИХТ=А/В.

После оценки индекса хемотаксиса приступают к определению экспрессии мембранных молекул на фагоцитах методом непрямой иммунофлюоресценции или ферментативной активности клеток.

Для определения экспрессии мембранных молекул применяют наборы для непрямой иммунофлюоресценции (например, набор КЛОНОСПЕКТР, г.Москва). Первым этапом на хемотаксические кольца наносят растворы соответствующих моноклональных антител, инкубируют 40-60 минут, после чего смывают забуференным физиологическим раствором или раствором Хенкса. На втором этапе на хемотаксические кольца наносят раствор антииммуноглобулиновых антител, меченных FITC. Инкубируют 40-60 минут при температуре +4-8°С и промывают раствором Хенкса. Микроскопию проводят в люминесцентном микроскопе при увеличении не менее ×630. Оценивают процент клеток в зоне миграции к хемоаттрактанту (ЭА) и от хемоаттрактанта (ЭВ), несущих флюоресцентную метку. После этого высчитывается индекс экспрессии (ИЭ) соответствующей молекулы по формуле:

ИЭ=ЭА/ЭВ.

Для оценки активности ферментов фагоцитов в зонах миграции применяют поствитальное окрашивание методом одновременного азосочетания по Пирсу с α-нафтилацетатом и прочным красным Б. Для этого готовятся растворы α-нафтилацетата (α-нафтилацетат - 10 мг; ацетон х.ч. - 0,5 мл; вода дистиллированная - 0,5 мл), прочного красного (прочный красный Б - 10 мг; фосфатный буфер 0,1 моль pH 7,3-7,5 - 7,5 мл; вода дистиллированная 7,5 мл) и 0,5% водный раствор метиленового зеленого. На первом этапе смесью растворов α-нафтилацетата и прочного красного выявляется активность ферментов группы неспецифических эстераз, а на втором этапе раствором метиленового зеленого контрастируются ядра фагоцитов. Оценку активности неспецифических эстераз производят при световой микроскопии при увеличении не менее ×630 полуколичественным способом. Оценивается степень активности эстераз по количеству окрашенных гранул и интенсивности их окраски в цитоплазме фагоцитов. При этом все клетки делятся на четыре группы: 0 - клетки с единичными бледными гранулами и без них; 1 - клетки с количеством гранул не более 1/3 площади ядра и с единичными яркими гранулами; 2 - клетки количеством гранул более 1/3 площади ядра, но не более площади ядра или с яркими гранулами не более 1/3 площади ядра; 3 - клетки с гранулами более площади ядра или с яркими гранулами более 1/3 площади ядра. Степень активности выражается активностью эстераз (процент клеток, дающих положительную реакцию) и суммарным цитохимическим коэффициентом (СЦК), который определяется по формуле:

СЦК=А×0+В×1+С×2+D×3,

где А - количество клеток с активностью 0; В - с активностью 1; С - с активностью 2; D - с активностью 3.

При этом оценивают процент клеток, обладающих эстеразной активностью в зоне миграции к хемоаттрактанту (АЭ-А) и от хемоаттрактанта (АЭ-В), а также суммарный цитохимический коэффициент в зонах миграции соответственно (СЦК-А и СЦК-В). После этого высчитываются индексы активности эстераз (ИАЭ) и суммарного цитохимического коэффициента (ИСЦК) соответственно:

ИАЭ=(АЭ-А)/(АЭ-В);

ИСЦК=(СЦК-А)/(СЦК-В).

Интерпретация результата исследования осуществляется следующим образом, если исследуемый индекс меньше 1 у.е., то это указывает на повреждение соответствующей функции фагоцита.

Пример № 1.

Пациентка Ю.Ю.С., 21 год. Из кишечника выделен золотистый стафилококк в титре 10⁶. Индекс хемотаксиса нейтрофилов периферической крови к золотистому стафилококку составил 0,96 у.е., к С5а фрагменту комплемента - 0,85 у.е. При этом при ответе на стафилококк индекс активности эстераз был 1,53 у.е., индекс суммарного цитохимического коэффициента - 1,52 у.е., индекс активации экспрессии CD11b - 0,71 у.е., индекс активации экспрессии CD13 - 0,50 у.е. При ответе на С5а фрагмент комплемента индекс активности эстераз был 1,16 у.е., индекс суммарного цитохимического коэффициента - 1,24 у.е., индекс активации экспрессии CD11b - 0,58 у.е., индекс активации экспрессии CD13 - 0,63 у.е.

Заключение: у пациентки Ю.Ю.С. золотистый стафилококк вызывает нарушение функций нейтрофилов, проявляющееся в торможении хемотаксиса на стафилококк и С5а фрагмент комплемента, при одновременном снижении активации кислородпродуцирующей функции, но сохранной кислороднезависимой ферментной активности. Рекомендуется проведение коррекции дисбиотического состояния и иммуномодулирующей терапии, направленной на нормализацию хемотаксической и кислородпродуцирующей функции нейтрофилов.

Пример № 2.

Здоровая мышь № «0-4» линии СВА весом 24,5 г. Выделили перитонеальные нейтрофилы и произвели оценку хемотаксической активности к золотистому стафилококку (ИХТ=2,50; ИАЭ=1,11; ИСЦК=1,16), иммуномодулятору «Бестим» (ИХТ=1,50; ИАЭ=1,02; ИСЦК=1,01), комплексному цитокиновому препарату «Лейкинферон» (ИХТ=1,22; ИАЭ=2,22; ИСЦК-3,66), С5а фрагменту комплемента (ИХТ=1,95; ИАЭ=3,72; ИСЦК=4,94).

Заключение: нормальная хемотаксическая и метаболическая реакция нейтрофилов на стафилококк, иммуномодулятор «Бестим», цитокиновый комплексный препарат «Лейкинферон», С5а фрагмент комплемента.

Пример № 3.

Здоровая мышь № «1-1» линии СВА весом 21,0 г. Для оценки влияния иммуномодулятора «Бестим» на активность фагоцитарных клеток вводили «Бестим» животному в дозе 0,002 мг пятикратно с интервалом в 24 часа. Выделили перитонеальные нейтрофилы и произвели оценку хемотаксической активности к золотистому стафилококку (ИХТ=2,00; ИАЭ=2,44; ИСЦК=2,97), иммуномодулятору «Бестим» (ИХТ=0,36; ИАЭ=1,03; ИСЦК=1,14), комплексному цитокиновому препарату «Лейкинферон» (ИХТ=1,50; ИАЭ=0,77; ИСЦК=0,55), С5а фрагменту комплемента (ИХТ=2,33; ИАЭ=1,23; ИСЦК=1,42).

Заключение: сохранение нормального кинетического и метаболического ответа нейтрофилов на стафилококк и С5а фрагмент комплемента, сохранение хемотаксиса при угнетении ферментативной активности при ответе на цитокины, специфическая хемотаксическая деактивация с сохранением метаболической реакции на «Бестим».

Пример № 4.

Пациентка В.О.С., 19 лет. Практически здорова. Произвели оценку хемотаксической активности нейтрофилов периферической крови к золотистому стафилококку (ИХТ=1,80; ИАЭ=0,33; ИСЦК=0,25; ИЭ(CD11b)=1,20), комплексному цитокиновому препарату «Лейкинферон» (ИХТ=1,00; ИАЭ=1,69; ИСЦК=1,67; ИЭ(CD11b)=2,00), С5а фрагменту комплемента (ИХТ=1,33; ИАЭ=0,43; ИСЦК=0,39; ИЭ(CD11b)=1,27).

Заключение: нормальная хемотаксическая реакция на хемоаттрактанты, торможение кислороднезависимого метаболического ответа на стафилококк и С5а фрагмент комплемента, нормальная активация экспрессии CD11b. Одновременно производилась оценка иммунограммы второго уровня. Выявлено снижение фагоцитарной реакции на монодисперсный полистирольный латекс. Рекомендуется динамическое наблюдение и при сохранении выявленных изменений стимуляция фагоцитарной функции фагоцитов.

Пример № 5.

Пациент С.А.М., 18 лет. Бронхиальная астма с преобладанием аллергического компонента, клиническая ремиссия. Произвели оценку хемотаксической активности нейтрофилов периферической крови к золотистому стафилококку (ИХТ=1,64; ИАЭ=1,68; ИСЦК=1,93; ИЭ(CD11b)=0,93), комплексному цитокиновому препарату «Лейкинферон» (ИХТ=1,40; ИАЭ=1,91; ИСЦК=2,10; ИЭ(CD11b)=1,24), аллергену домашней пыли (ИХТ=0,90; ИАЭ=0,76; ИСЦК=0,60; ИЭ(CD11b)=0,73).

Заключение: сохранение нормального кинетического и метаболического ответа нейтрофилов на стафилококк и «Лейкинферон», угнетение хемотаксического и метаболического ответа на аллерген. Рекомендуется проведение специфической десенсибилизирующей терапии аллергеном.

В сравнении с прототипом заявляемый способ позволяет более точно выявить нарушения функции фагоцитов при развитии хронических рецидивирующих инфекционных и других (например, аллергических) процессов, что обеспечивает более точную диагностику.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии, микробиологии, фармакологии, клинической фармакологии, и может использоваться для мониторинга состояния клеточного иммунитета при иммунодефицитных состояниях. Заявлен способ выявления нарушения функции фагоцитов при развитии хронических рецидивирующих инфекционных процессов, заключающийся в том, что выделяют из крови больного лейкоциты, отмывают их от сыворотки, оценивают ферментативную активность фагоцитов, определяют активность эстераз и средний цитохимический показатель, отличающийся тем, что дополнительно оценивают функциональную активность фагоцитов на фиксированных клетках, включая определение рецепторов клеток, с помощью набора моноклональных и поликлональных антител методом иммуно-флюоресценции с использованием поствитального окрашивания, исследуют in vitro хемотаксис фагоцитов, определяют индекс хемотаксиса и вычисляют дополнительно индекс экспрессии, индекс активности эстераз и индекс суммарного цитохимического коэффициента. Изобретение обеспечивает более высокую детализацию элементов нарушения функции фагоцитов, позволяющую более точно дифференцировать вид нарушения.

Способ выявления нарушения функции фагоцитов при развитии хронических рецидивирующих инфекционных процессов, заключающийся в том, что выделяют из крови больного лейкоциты, отмывают их от сыворотки, оценивают ферментативную активность фагоцитов, определяют активность эстераз и средний цитохимический показатель, отличающийся тем, что дополнительно оценивают функциональную активность фагоцитов на фиксированных клетках, включая определение рецепторов клеток, с помощью набора моноклональных и поликлональных антител методом иммунофлюоресценции с использованием поствитального окрашивания, исследуют in vitro хемотаксис фагоцитов, стимулируя их факторами хемотаксиса и оценивая способность фагоцитов к направленной миграции, поместив их в чашку Петри с агарозой, определяют индекс хемотаксиса и вычисляют дополнительно индекс экспрессии, индекс активности эстераз и индекс суммарного цитохимического коэффициента, затем оценивают результаты исследований по величине индекса хемотаксиса и делают выводы о наличии дефекта функции фагоцитов при величине индекса хемотаксиса меньше 1 условной единицы и виде инфекции, а при величине индекса экспрессии, индекса активности эстераз и индекса суммарного цитохимического коэффициента меньше 1 условной единицы делают выводы о нарушении рецепции и ферментативной активности фагоцитов.