СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ ПРИ АЛЛЕРГИИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно аллергологии и иммунологии, и может быть использовано в практике клинических аллергологических и иммунологических лабораторий при оценке иммунного ответа (фагоцитоза) на аллергены у взрослых и детей.

В медицинской практике оценку клеточного иммунного ответа (фагоцитоза) к аллергенам проводят разными методами и различными биореагентами.

Известен способ оценки функциональной активности фагоцитов периферической крови человека с помощью стафилококков, меченых изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ-меченых стафилококков).

Мазуров Д.В., Хамидуллина К.Ф., Пинегин Б.В. Комплексный метод для оценки функциональной активности фагоцитарных клеток периферической крови. //Медицинская иммунология, 1999, т.1, №3 и 4, с.74 и 75.

Мазуров Д.В., Пинегин Б.В. Применение проточной цитометрии для оценки поглотительной и бактерицидной функций гранулоциотов и моноцитов периферической крови //Аллергия, астма и клиническая иммунология, 1999, №9, с.154-156.

Недостатки: метод включает использование химических реагентов, центрифугирование лейкоцитов, что ведет к повреждению клеток, а их фракционирование методом проточной цитометрии способствует активации фагоцитирующих клеток и, следовательно, к изменениям результатов и достоверности метода.

Наиболее близким аналогом является способ определения фагоцитоза с применением формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ).

Каплин В.Н. Нетрадиционная иммунология инфекций. - Пермь: Пермская гос. мед. академия, 1966, 163 с.

Каплин В.Н., Кузнецов В.Ф., Обернесова Т.П. Методические аспекты изучения фагоцитоза //I съезд иммунологов России: Тез. Докл. (23-25 июня 1992 г.). - Новосибирск, 1992, с.200 и 201.

Шилов Ю.И., Владыкина В.П., Атнагузина А.Т. Некоторые методические подходы к оценке показателей общего и дифференцированного фагоцитоза лейкоцитов периферической крови. Характеристика различий у здоровых людей //Пермский медицинский журнал, 1998, №2 и 3, т.XV, с.3-9.

Недостатки: метод с использованием ФЭБ не позволяет регистрировать переваривающую способность фагоцитов, а только поглотительную, что ведет к неполной оценке фагоцитоза, кроме того, окраска мазков по Романовского-Гимзе снижает чувствительность метода.

Изобретение направлено на решение задач: повышение чувствительности способа и возможность оценки переваривающей способности фагоцитов.

Указанные задачи достигаются путем соединения объекта фагоцитоза - ФЭБ с цельной кровью и расчета поглотительной способности фагоцитов. Способ отличается тем, что в качестве объекта фагоцитоза используют меченые корпускуляризованные аллергенспецифические диагностикумы (мКАД). Меченые корпускуляризованные аллергендиагностикумы представляют собой формалинизированные, танизированные эритроциты барана, сенсибилизированные определенным пищевым, бытовым, пыльцевым аллерегеном, меченным флуоресиентным красителем (флуоресцеин изотиоиианатом - ФИТЦ или тетрародамина изотиоцианатом - ТРИТЦ). Полученную смесь делят на две порции по 100 мкл, первую инкубируют в течение 20 мин, а вторую - в течение 120 мин при температуре 37°С, затем, сразу же по истечении сроков инкубации, в каждую пробирку добавляют по 10 мкл формалина, готовят мазки на предметном стекле, высушивают на воздухе, просматривают под иммерсионным объективом люминесцентного микроскопа, подсчитывают не менее 100 фагоцитов, поглотивших и не поглотивших мКАД. Проводят расчет показателей суммарного фагоцитоза: процент фагоцитоза, фагоцитарное число, фагоцитарный индекс, эффективность фагоцитоза и вычисляют индекс переваривающей способности фагоцитов по формуле

где Х - индекс переваривающей способности фагоцитов;

Y - эффективность фагоцитоза через 20 мин;

Z - эффективность фагоцитоза через 120 мин,

и при величине Х меньше (50±3)% определяют повреждение функциональной активности фагоцитов при аллергии.

Способ осуществляют следующим образом: объект фагоцитоза - мКАД соединяют с цельной кровью, полученную смесь делят на две части по 100 мкл, первую инкубируют в течение 20 мин; а вторую - в течение 120 мин при температуре 37°С, затем, сразу же по истечении сроков инкубации, в каждую пробирку добавляют по 10 мкл формалина, готовят мазки на предметном стекле, высушивают на воздухе в течение 5-7 мин, просматривают под иммерсионным объективом люминесцентного микроскопа и подсчитывают не менее 100 всех фагоцитов, поглотивших и не поглотивших мКАД. Проводят расчет показателей суммарного фагоцитоза: процент фагоцитоза, фагоцитарное число, фагоцитарный индекс, эффективность фагоцитоза.

Определение функциональной (поглотительной) активности всех типов фагоцитов проводят путем подсчета 100 фагоцитировавших и нефагоцитировавших клеток в обеих порциях (20 мин и 120 мин) исследуемой взвеси и расчета нижеследующих показателей.

(Бахметьев Б.А., Ширшов С.В., Кеворков Н.Н. Основные показатели иммунограммы детей и взрослых Пермской области.-Пермь, 2002, 44 с.)

Процент фагоцитоза - количество клеток, захвативших мКАД, из 100 подсчитанных фагоцитов.

Фагоцитарное число - количество мКАД которое в среднем приходится на 1 из 100 подсчитанных фагоцитов.

Фагоцитарный индекс - количество мКАД, которое приходится на одну фагоцитировавшую клетку.

Эффективность фагоцитоза - абсолютное число поглощенных мКАД фагоцитами в расчете на 1 мм³ крови.

Расчет функциональной (переваривающей) активности фагоцитоза:

Число переваренных мКАД - разность эффективностей фагоцитоза через 20 мин и 120 мин экспозиции порций исследуемой смеси крови.

Индекс функциональной (переваривающей) способности фагоцитов представляет собой частное от деления разности эффективностей фагоцитоза 20-минутной и 120-минутной порций исследуемых смесей крови, на эффективность фагоцитоза при 20 мин и выражают в процентах.

Формула вычисления индекса переваривающей способности фагоцитов

где Х - индекс переваривающей способности фагоцитов;

Y - эффективность фагоцитоза через 20 мин;

Z - эффективность фагоцитоза через 120 мин,

и при величине Х меньше (50±3)% определяют повреждение функциональной активности фагоцитов при аллергии.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Ребенок А. 12 лет. Обратился с жалобами на появление кожных высыпаний на коже лица после употребления в пищу колбасы, коровьего молока.

Анамнез заболевания: проявления аллергического диатеза в виде высыпаний, проявляющихся легкой гиперемией, экссудацией, шелушением и появлением папул, сопровождающихся зудом кожных покровов, отмечает с 3 лет на молочные продукты. Наследственность по аллергически заболеваниям отягощена: у матери - атопический дерматит. Обострения возникают 1-2 раза в год при нарушении диеты. Продолжительность ремиссии 6-8 месяцев.

Данные объективного осмотра: на коже лица гиперемия, наличие папул, геморрагических корочек, расчесов.

Зев спокоен, язык обложен белым налетом. Пальпируются единичные подчелюстные лимфоузлы. В легких дыхание везикулярное. Тоны сердца приглушены, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный. Проведено исследование крови: лейкоциты - 7100, палочкоядерные нейтрофилы - 1, сегментоядерные нейтрофилы - 41, эозинофилы - 10, моноциты - 9, лимфоциты - 39, иммуноглобулины классов: Ig G (г/л) - 7,7, IgA (г/л) - 2,8, IgM (г/л) – 1,1, IgE (ME/мл) - 800.

Диагноз. Ограниченный атопический дерматит, легкое течение, период манифестации. Пишевая сенсибилизация (аллергия).

Результат исследования: поглотительная способность фагоцитов в пределах нормы, переваривающая способность способность фагоцитов снижена и составляет 29%.

Пример 2.

Больная П. 60 лет.

Жалобы на чихание, зуд носа, глаз, затрудненное дыхание после посещения цирка, зоопарка, контакта с кошкой, работе с животными.

В период осмотра состояние удовлетворительное. Зев спокойный, лимфоузлы не увеличены. Дыхание жесткое, хрипов нет. Тоны сердца приглушены, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный.

Обследование. 1. Спирография. Есть риск по снижению ФЖЭЛ на границе условной нормы. Время выдоха увеличено. Проба с бронходилятатором положительная.

2. Индекс местной эозинофилии 4, 3

3. Общий IgE 285 ME/ мл

4. Специфический IgE: ШК 3+,

5. Скарификационные кожные пробы: ТЮК отриц., гистамин 2+, шерсть кошки 2+, перхоть лошади 2+.

6. Внутрикожные пробы ТКЖ отриц., гистамин 3+, шерсть кошки 2+, домашняя пыль 2+, библиотечная пыль 2+.

7. Непрямой метод флуоресцирующих антител: шерсть кошки 1-2+, домашняя пыль 2+.

Проведено исследование крови: лейкоциты - 5600, палочкоядерные нейтрофилы - 3, сегментоядерные нейтрофилы - 43, эозинофилы - 11, моноциты - 7, лимфоциты - 36, иммуноглобулины классов: lg G (г/л) - 15,6, IgA (г/л) - 2,39, IgM (г/л) - 2,14, IgE (ME/мл) - 285.

Диагноз. Бытовая, эпидермальная сенсибилизация (аллергия).

Бронхиальная астма атоническая, субремиссия.

Аллергический ринит, интермиттирующий, ремиссия.

Аллергический конъюнктивит, интермиттирующий, ремиссия.

Результат исследования: поглотительная способность фагоцитов в пределах нормы, переваривающая способность способность фагоцитов снижена и составляет 33,6%.

Пример 3.

Больной Ив., 1989 года рождения

Жалобы не предъявляет. Проходит медосмотр в связи с поступлением на работу.

В момент осмотра состояние удовлетворительное. По внутренним органам без отклонений.

Проведено исследование крови: лейкоциты - 6800, палочкоядерные нейтрофилы - 2, сегментоядерные нейтрофилы – 48, эозинофилы - 2, моноциты – 5, лимфоциты - 43, иммуноглобулины классов: Ig G (г/л) - 16,9, IgA (г/л) - 2,6, IgM (г/л) - 1,28, IgE (ME/мл) - 80.

Результат исследования: функциональная (поглотительная и переваривающая) способность фагоцитов в пределах нормы.

Диагноз. Практически здоров. Годен для работы в лаборатории.

Положительный эффект. Способ позволяет повысить чувствительность анализа за счет использования мКАД, а также оценить переваривающую способность фагоцитов, что важно для поиска нарушений основных этапов фагоцитоза как на стадии диагностики, так и на стадии лечения аллергических заболеваний.

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано при оценке иммунного ответа на аллергены. Сущность способа состоит в том, что соединяют меченные корпускуляризованные аллергенспецифические диагностикумы (мКАД) с цельной кровью, полученную смесь делят на две порции, первую инкубируют в течение 20 мин, а вторую - в течение 120 мин при температуре 37°С, затем, по истечении сроков инкубации, в каждую пробирку добавляют формалин, готовят мазки на предметном стекле, высушивают на воздухе, просматривают под иммерсионным объективом люминесцентного микроскопа, подсчитывают число клеток, поглотивших и не поглотивших мКАД, рассчитывают показатели функциональной (поглощающей и переваривающей) активности фагоцитов и вычисляют индекс переваривающей способности фагоцитов по формуле

где Х - индекс переваривающей способности фагоцитов; Y - эффективность фагоцитоза через 20 мин; Z - эффективность фагоцитоза через 120 мин, и при величине Х меньше (50±3)% определяют повреждение функциональной активности фагоцитов при аллергии. Техническим результатом является повышение чувствительности способа и возможность оценки переваривающей способности фагоцитов. 3 табл.

Способ определения функциональной активности фагоцитов при аллергии путем соединения объекта фагоцитоза с цельной кровью, отличающийся тем, что в качестве объекта фагоцитоза используют меченые корпускуляризованные аллергенспецифические диагностикумы (мКАД), соединяют с цельной кровью, полученную смесь делят на две части, первую инкубируют в течение 20 мин, а вторую - в течение 120 мин при температуре 37°С, затем, по истечении сроков инкубации, в каждую пробирку добавляют формалин, готовят мазки на предметном стекле, высушивают на воздухе, просматривают под иммерсионным объективом люминесцентного микроскопа, подсчитывают число клеток, поглотивших мКАД, рассчитывают показатели поглотительной и переваривающей активности фагоцитов и вычисляют индекс переваривающей способности фагоцитов по формуле

где Х - индекс переваривающей способности фагоцитов;

Y - эффективность фагоцитоза через 20 мин;

Z - эффективность фагоцитоза через 120 мин,

и при величине Х меньше 50±3% определяют повреждение функциональной активности фагоцитов при аллергии.