СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАНТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 1994 года по МПК G09B23/28 A61B17/00 A61N1/32 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, преимущественно к способам сохранения функции пересаженных органов путем патофизиологической коррекции.

Известен способ хирургической реиннервации пересаженной почки (1), заключающийся в том, что во время выполнения трансплантации сшивают периваскулярные фасциально-клетчаточные лоскуты почечной артерии трансплантата с ветвями вегетативного нервного сплетения, расположенного на подвздошных сосудах, или с подчревным нервом.

Основной недостаток способа заключается в том, что для врастания нервов в пересаженный орган (т. е. , пока нервные проводники в процессе роста достигнут клеток нефрона, сосудов и др. клеток-мишеней) требуется 3-6 месяцев, и если в течение этого срока не обеспечить коррекцию метаболизма почек, например, введением фармакологических препаратов, то в нефронах развиваются дистрофические изменения. Таким образом, к моменту восстановления нервных связей между организмом и трансплантатом в последнем развиваются необратимые изменения, не позволяющие в дальнейшем каким-либо образом восстановить функциональную полноценность пересаженного органа.

Наиболее близким к изобретению является способ, заключающийся в том, что в циркулирующее русло реципиента вводят дофамин с целью модулирования фармакологической реиннервации трансплантата. Способ включает следующие приемы: выполняют денервацию почки и контрлатеральную нефрэктомию; ежедневно в кровеносное русло вводят дофамин в дозе 0,025 мг/кг; определяют клиренс эндогенного креатинина, диурез, осмолярность, концентрацию электролитов и белок мочи, а также производят гистологическое исследование почек.

Способ хотя и позволяет грубо модулировать влияние нервной системы на перенхиматозные, стромальные и нервные элементы почечного трансплантата в раннем периоде после пересадки, тем не менее имеет ряд недостатков. "Нервная трофика" обеспечивается действием на клетки-мишени почки разнообразных биологически активных веществ (в том числе медиаторов: норадреналина, пурина, дофамина и др. , а также нейропептидов - субстанции Р, эндорфинов), синтезирующихся исключительно в нервной клетке. Поэтому всякие попытки использования лекарственных веществ (дофаина, норадреналина и др. ) с целью фармакологической реиннервации требуют изучения не только оптимальной дозы препарата, но, что более важно, подбора синтетических аналогов нейротрофических веществ и их оптимальных соотношений. Эта задача представляется неразрешимой, если учесть изменение чувствительности клеток-мишеней к медиаторам при денервации органа, например, повышение сродства рецепторов к катехоламинам - эффект Кеннона-Розенблюта. Любой фармакологический препарат, не исключение и дофамин, при введении в сосудистое русло оказывает системное гемодинамическое действие: повышение сопротивления периферических сосудов, систолического артериального давления, что нежелательно для реципиентов, страдающих хронической почечной недостаточностью и находящихся на длительном гемодиализе.

Целью изобретения является длительное сохранение функциональной полноценности почечного трансплантата. С целью профилактики дистрофических изменений в интрамуральном нервном аппарате пересаженного органа сразу после пересадки осуществляют электрическую стимуляцию внутриорганных нейронов почки, для чего в области ее порот подшивают электроды и наносят электрические импульсы с частотой 80-100 Гц, длительностью 0,5 м/с и амплитудой 3-4 В круглосуточно сеансами по 5 мин с интервалами 10 мин в течение всего периода наблюдения.

Существенно новыми признаками способа являются: в связи с существованием в почечном трансплантате интрамуральных нейронов, сохраняющих активность до 3-4 недель после пересадки, а также на основании установленных связей их нервных окончаний с почечными канальцами и кровеносными сосудами органа, используем эти нейроны в качестве источника иннервации; для сохранения функциональной активности интрамуральных нейронов, а следовательно, поступления нейротрофических веществ к клеткам-мишеням, и увеличения нервных контактов с последними модулируем естественную преганглионарную импульсацию путем электрической стимуляции.

Предлагаемый способ содержит следующие основные приемы: наркотизируют животное внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия (40 мг/кг массы). Срединным разрезом вскрывают брюшную полость, выполняют нефрэктомию справа, выделяют сосудистую ножку левой почки и пересекают все нервы, идущие к воротам почки. Моделируют ишемию левой почки, например, пережатием почечных сосудов на 30-40 мин. Удаляют наружную оболочку почечной артерии, вены и юксталоханочного отдела мочеточника. Обрабатывают элементы почечной ножки 5% -ным раствором фенола в абсолютном спирте. Выполняют декапсуляцию почки. Восстанавливают кровоток в почке, удаляя турникет с почечных сосудов. На область ворот почки нашивают серебрянные электроды с изолированной нерабочей поверхностью, соединенные проводниками с портативным радиоприемником. Поперечную и косые мышцы живота разводят на границе с поясничной мышцей и под кожей спины формируют тоннель, в который помещают радиоприемник. Мышцы ушивают отдельными кетгутовыми швами. Рану передней брюшной стенки ушивают послойно наглухо. Животное помещают в экранированную клетку с расположенной на полу радиоантенной. Выполняют электрическую радиостимуляцию животных, круглосуточно сеансами по 5 мин с интервалами 10 мин, в течение всего периода наблюдения. Осуществляют гистологическое изучение почек экспериментальных животных. Определяют морфологические показатели: удельные объемы неизмененных, реактивно измененных и деструктивно измененных нейроцитов интрамурального нервного аппарата почки. Иннервационный индекс эпителия проксимальных и дистальных канальцев. Рассчитывают коэффициент энергетической эффективности митохондрий эпителиальных клеток дистальных канальцев нефронов по формуле:
КЭЭМ = × 100% , , где Σ кр _н - сумма крист в одной электроннограмме в норме;
Σкр _п - сумма крист в одной электроннограмме при патологии;
ΣS _н - сумма площадей митохондрий в одной электронограмме в норме;
Σ S _п - сумма площадей митохондрий в одной электронограмме при патологии.

Определяют функциональные показатели: диурез, концентрацию натрия в плазме крови и моче, концентрацию креатинина в плазме крови и моче; скорость клубочковой фильтрации, реабсорбируемую фракцию натрия. Концентрацию натрия в плазме крови и моче определяют методом плазменной фотометрии. Концентрацию креатинина в плазме крови и моче оценивают по реакции Яффе. Рассчитывают уровень клубочковой фильтрации (QF), реабсорбируемую фракцию натрия (RF Na) известными методами.

П р и м е р. Крысу-самца массой 180 г наркотизировали путем введения раствора пентобарбитала натрия (40 мг/кг массы) внутрибрюшинно. По достижении 3 стадии наркоза вскрывали брюшную полость. Выделяли сосудистую ножку и мочеточник правой почки, перевязывали их и пересекали. Почку удаляли. Обнажали сосудистую ножку левой почки и пересекали все нервы, идущие к воротам почки вдоль сосудов и мочеточника, а затем удаляли адвентицию артерии, вены и юксталоханочного отдела мочеточника. Обрабатывали элементы почечной ножки 5% -ным раствором фенола в абсолютном спирте. Выполняли 40-минутную ишемию наложением турникета на почечные сосуды, после чего удаляли с органа капсулу. На область ворот нашивали округлые серебрянные пластинчатые электроды диаметром 4 мм и толщиной 0,1 мм, с изолированной парафином нерабочей поверхность, соединенные проводниками с портативным радиоприемником, состоящим из деталей промышленного производства. Поперечную и косые мышцы живота тупо разводили на границе с поясничной мышцей и под кожей спины формировали тоннель, в который помещали радиоприемник. Мышцы ушивали отдельными кетгут овыми швами, после чего рану передней брюшной стенки ушивали наглухо. Животное помещали в экранированную клетку с расположенной на полу излучающей радиоантенной. подключенной к радиопередатчику. Последний подключали к лабораторному электростимулятору ЭСЛ-1. при помощи которого задавали параметры стимуляции: частота 100 Гц, длительность 0,5 м/с, амплитуда 3 В, электрическую стимуляцию осуществляли сеансами по 5 мин с интервалами 10 мин в течение 30 сут. На 30 сут после операции согласно задачам исследования оперировано животное было выведено из эксперимента. В этот период наблюдения удельные объемы неизменных и реактивно измененных нейроцитов составили 36,9±1,3% и 56,6±2,8% на фоне низкого удельного объема деструктивно измененных нейронов (6,5±04% ); значения КЭЭМ и иннервационного индекса почечных канальцев были равны 91.8±4,0% и 231±12 /в 0,01 мм² соответственно. Уровень клубочковой фильтрации и реабсорбируемой фракции натрия составлял соответственно 0,251±0,01 мл/мин и 90.6±3,7% .

Таким образом, представленные результаты наблюдения показали, что предлагаемый способ позволяет добиться сохранения жизнеспособности и нейротрофических влияний интрамуральных нейронов на структурные элементы почки и дает возможность сохранить функцию трансплантата на достаточном уровне к 30 сут после оперативного вмешательства.

С целью доказательства преимуществ заявляемого способа и выбора оптимальных значений указанных параметров электрической стимуляции (частоты) были проведены исследования на 4 группах экспериментальных животных:
1 группа - 10 крыс, которым осуществлялась фармакологическая реиннервация по способу-прототипу;
2 группа - крыс, которым выполнялась электрическая стимуляция интрамурального нервного аппарата с частотой 1 Гц;
3 группа - 7 крыс, которым выполнялась электрическая стимуляция интрамурального нервного аппарата с частотой 80-100 Гц;
4 группа - 7 крыс, которым выполнялась электрическая стимуляция интрамурального нервного аппарата с частотой 120-150 Гц.

Амплитуда 3-5 В и длительность импульса 0,5 мс были одинаковы во 2,3 и 4 группах. Стимуляцию проводили круглосуточно сеансами по 5 минут с интервалами 10 минут.

При морфологическом изучении почек животных 1 группы, получавших дофамин (по способу-прототипу), на 7 сут эксперимента отмечали расширение сосудистых клубочков, утолщение базальных мембран, набухание цитоплазмы подоцитов. гидропические изменения эндотелиоцитов. Имели место набухания эпителиоцитов почечных канальцев, что сопровождалось уменьшением их просвета; гиперемия кровеносных сосудов; плазматическая инфильтрация соединительнотканых прослоек, увеличение числа тучных клеток, пролиферация интерстициальных клеток. Описанные изменения сочетались со снижением коэффициента энергетической эффективности митохондрий эпителиальных клеток канальцев нефронов, низким иннервационным индексом почечного эпителия, большим удельным объемом реактивно измененных интрамуральных нейронов и сопровождались высоким уровнем клубочковой фильтрации и диуреза. На 15 сут исследования - морфологические изменения усиливались и проявлялись в увеличении просветов капилляров сосудистого клубочка, набухании их эндотелиоцитов, заполнении полостей капсул почечных клубочков фибриноидом, пролиферации мезангиальных капсул почечных клубочков фибриноидом, пролиферации мезангиальных клеток, появлении деструктивно измененных эпителиоцитов наружного листка капсулы клубочка. Нарастали дистрофические и некротические изменения в нейроцитах почечных канальцев. Капилляры перитубулярной сети расширялись. Выявляли большое число делящихся из плазматических клеток, лейкоцитов, магофагов. КЭЭФ эпительальных клеток дистальных канальцев возрос по сравнению с предыдущими сроками наблюдения. Увеличился удельный объем реактивно и деструктивно измененных нейронов интрамуральной нервной системы. Иннервационный индекс сохранялся неизмененным. Диурез оставался высоким, уровень гломерулярной фильтрации снизился по сравнению с предыдущими сроками, реабсорбируемая фракция натрия возрастала. На 30 сут в почечных тельцах были выявлены явления сморщивания и склерозирования. Часть эпителиоцитов почечных канальцев некротически изменена. В сроме определялись клеточные инфильтраты, значительное количество фибробластов, уменьшение числа интерстициальных клеток. Высоким оставался удельный объем реактивно и деструктивно измененных нервных клеток. Иннервационный индекс канальцевого эпителия значительно снижался. По-прежнему оставался увеличенным диурез, регистрировали сниженный уровень гломерулярной фильтрации. Реабсорбируемая фракция натрия хотя и несколько возрастала, одна не достигала нормальных значений.

Таким образом, динамика морфологических и функциональных показателей у животных 1 группы, получавших дофамин, свидетельствует о прогрессировании к 30 сут исследования деструктивных и склеротических явлений в денервиpованной почке на фоне фармакологической реиннервации, а также о низкой (относительно интактного органа) способности реабсорбировать натрий в результате развивающегося энергодефицита. К концу срока наблюдения в 80% животных данной группы развивалась функциональная неполноценность почки и лишь у 20% - орган функционировал удовлетворительно.

Морфологическое изучение почек животных 2 группы на 7 сут электрической стимуляции показало сохранение обычных размеров клубочков, суженные афферентные и эфферентные артериолы, фрагментацию эндотелия капилляров почечных клубочков, набухание ядер эндотелиоцитов, в просвете капсулы скопление фибриноида, появление гранул в мезангиальных клетках, дегрануляцию эпителиоидных клеток афферентных артериол. В эпителиальных клетках 13.2% почечных канальцев отмечали зернистую дистрофию, слущивание щеточной каемки в 5,0% проксимальных отделов, пролиферацию интерстициальных клеток мозговой зоны почки. Величина коэффициента энергетической эффективности митохондрий почечных канальцев хотя и была ниже нормальной. однако превышала таковую у животных 1 группы. Для нейроцитов характерно сохранение достаточно большого удельного объема неизмененных, низкий удельный объем деструктивно измененных, чем в 1 группе животных. Наблюдали более низкие, приближающиеся к нормальным показателям диуреза, клубочковой фильтрации и высокий уровень реабсорбируемой фракции натрия по сравнению с 1 группой. На 15 сут эксперимента 7,0% почечных телец было атрофировано, в остальных имели место расширенные капилляры, пролиферация мезангиальных клеток. Эпителиоциты почечных канальцев были набухшие, часть из них деструктивно изменена. В строме обнаруживали клеточные инфильтраты. Кровеносные сосуды мозгового вещества почки были расширены. Темпы роста деструктивно измененных нервных клеток снижались значительно в сравнении с 1 группой. Значения диуреза увеличивались, а реабсорбируемая фракция натрия снижалась и была такой же как и в 1 группе, на фоне неизменной скорости клубочковой фильтрации, что согласовалось с низкими коэффициентом энергетической эффективности митохондрий дистальных канальцев и иннервационным индексом почечных канальцев. На 30 сут исследования увеличилось количество спавшихся почечных клубочков, особенно суперфициальной зоны коры почки, число некротически измененных почечных канальцев достигло 37,2% , просветы которых заполнены случившимся эпителием. Удельный объем деструктивно измененных нейроцитов интрамуральной нервной системы почки снижался в 4,5 раза, чем у крым 1 группы. Иннервационный индекс почечных канальцев был ниже, чем в норме, но превышал таковой в 1 группе. Диурез снижался, увеличивалась реабсорбируемая фракция натрия по сравнению с группой животных, получавших дофамин. Коэффициент энергетической эффективности митохондрий эпителиоцитов дистальных канальцев хотя и возрастал, однако не достигал нормальных значений.

Таким образом, электрическая стимуляция с частотой 1 Гц замедляла прогрессирование деструктивных изменений в почечном трансплантате, а также несколько повышала ее реабсорбционные возможности. Удовлетворительное функционирование почек наблюдалось у 40% животных.

Изучение состояния почки в условиях электрической стимуляции с частотой 80-100 Гц показало, что в динамике эксперимента дистрофические и некротические изменения в нефронах. а также их функциональная неполноценность очень медленно нарастали даже к 30 сут. На 7 сут эксперимента в почке отмечали незначительное количество набухших и с признаками белковой дистрофии дистальных канальцев, неизменные проксимальные канальцы и собирательные трубки, слегка расширенные перитубулярные капилляры. Просветы капсул почечных телец были заполнены ультрафильтратом. Прямые сосуды мозгового вещества почки были без изменений. Эти морфологические изменения сопровождались относительно высоким уровнем коэффициента энергетической эффективности митохондрий дистальных канальцев (относительно животных 1 группы), незначительно возросшими в сравнении с нормой минутным диурезом и скоростью клубочковой фильтрации (но существенно ниже показателей 1 группы), а также низким уровнем реансорбируемого натрия. В популяции интрамуральных нервных клеток наблюдали высокое, одинаковое в сравнении с 1 группой, содержание реактивно измененных, больший, чем у животных 1 группы, удельный объем неизмененных нейронов и малое количество деструктивно измененных нейроцитов. Иннервационный индекс почечных канальцев оставался в пределах значений интактной почки. На 15 сут электрической стимуляции с указанными параметрами были выявлены увеличенные в размерах за счет расширения просветов капилляров и скопления в мочевом пространстве ультрафильтрата почечные клубочки; рост числа гидропически измененных дистальных и появление дистрофически измененных проксимальных канальцев, уменьшение количества гранулосодержащих эпителиоидных клеток эфферентных артериол; расширение просветов прямых сосудов, плазматизация с появлением макрофагов в интерстиции мозговой зоны почки. Указанным нарушениям соответствовали сниженный по сравнению с нормой коэффициент энергетической эффективности митохондрий эпителия дистальных канальцев. Характерно, что на фоне одинаковых значений скорости клубочковой фильтрации (в сравнении с 1 группой), регистрировали более низкий, хотя и выше нормы, минутный диурез, высокую реабсорбцию натрия. Сохранялось большое число реактивно измененных нейронов интрамурального нервного аппарата, более низким, чем в 1 группе был удельный объем деструктивно измененных нейронов. Значительно повышался (выше, чем у интактных и животных 1 группы) иннервационный индекс эпителия канальцев. На 30 сут эксперимента в почке регистрировали единичные спавшиеся почечные клубочки суперфициальных нефронов. В проксимальных и дистальных канальцах отмечали незначиельную часть некротически измененных эпитаксиальных клеток, Перитубулярные капилляры и сосуды мозгового вещества не изменены. Значения коэффициента энергетической эффективности митохондрий клеток дистальных канальцев первышают его значения в предыдущие сроки и приближаются к нормальным. Отмечалось дальнейшее увеличение иннервационного инднекса эпителия канальцев почки. В составе интрамурального нервного аппарата преобладади реактивно измененные нейроциты на фоне низкого содержания погибших нервных клеток. Функциональные показатели состояния почки незначительно отличались от показателей интактного животного и отражали эффективность электрической стимуляции с частотой 80-100 Гц. Следовательно, у животных 2 группы даже на 30 сут эксперимента не возникали серезные декструктивные нарушения и регистрировались приближенные к нормальным функциональные показатели, что позволяет говорить о 100% функциональной полноценности почек.

При изучении почек, подвергнуты электрической стимуляции с частотой 120-150 Гц, а динамике эксперимента были выявдлены морфологические изменения, свидетельствующие о более выраженном дистрофическом процессе. Это проявлялось в увеличении количества склерозированных почечных телец, увеличении доли некротически измененных как проксимальных, так и дистальных почечных канальцев, расширении перитубулярных капилляров коровой и прямых сосудов мозговой зон почки, ростом числа погибших интерстициальных клеток, обилием клеточных инфильтратов в межклеточных пространствах. Среди нейроцитов интрамурального нервного аппарата преобладали реактивно измененные; удельный вес дистрофически измененных нервных клеток был высоким и одинаковы с 1 группой. Иннервационный индекс почечных канальцев не отличался от такового во 2 группе. Коэффициент энергетической эффективности оставался сниженным в сравнении с нормой и 1 группой животных даже на 30 сутки исследования. Значения функциональных показателей к концу эксперимента не достигали нормальных. Удельная доля полноценно функционирующих почек составила 43% .

Таким образом, наиболее оптимальным режимом стимуляции, как видно из табл. 1,2,3, является электрическая стимуляция с частотой 80-100 Гц. Именно при таких значениях частоты импульсов достигается наиболее полноценное сохранение жиизнеспособности интраморальных нейронов почечного трансплантата, что демонстрирует табл. 3, а именно, если в 1-й группе на 30 сут исследования количество деструктивно измененных нейроцитов было равно 27,3±1,5% , а неизмененных 2,7±0,1% , то в 3 группе высок удельный объем неизменных нейронов (24,9±1,0% ) и низок удельный объем деструктивно измененных нервных клеток (3,1±0,1% ). У животных, получавших дофамин, уже на 7 сут эксперимента высокий удельный объем деструктивно измененных нервных клеток (12,4±0,8% ) и относительно низок удельный объем неизмененных нейонов (21,0±0,9% ).

Следовательно, оптимальное решение поставленное задачи имеет место при электрической стимуляции интрамурального нервного аппарата с частотой 80-100 Гц, длительностью 0,5 м/c, амплитудой 3-4 В, о чем свидетельствует снижение в 9 раз числа деструктивно измененных нейронов и повышение в 9 раз удельного объема неизмененных нейроцитов по сравнению с фармакологической реиннервацией по способу прототипу, а главное - сохранение функциональной полноценности в 100% наблюдений, что в 5 раз превышает эффективность фармакологической реиннервации дофамином (30% удовлетворительно функционирующих почек). (56) Шумаков В. И. Фармакологическая защита трансплантата, М. : 1983.

Изобретение относится к экспериментальной медицине. Сущность изобретения: проводят электрическую стимуляцию внутриорганных нейронов почки, для чего подвешивают электроды к области ее ворот и наносят электрические импульсы с частотой 80 - 100 Гц, длительностью 0,5 м/с и амплитудой 3 - 4 В круглосуточно сеансами по 5 мин с интервалами 10 мин в течение всего периода наблюдения. Способ позволяет сохранить функциональную полноценность почечного трансплантата в эксперименте.

СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАНТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ, включающий поддержание нервно-трофических связей, отличающийся тем, что осуществляют электрическую стимуляцию внутриорганных нейронов почки, для чего подшивают электроды в области ее ворот и наносят электрические импульсы с частотой 80 - 100 Гц, длительностью 0,5 мс и амплитудой 3 - 4 В круглосуточно сеансами по 5 мин с интервалами 10 мин в течение всего периода наблюдения.