СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ Российский патент 1994 года по МПК A61K39/40 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению диагностических препаратов, в частности для получения высокоактивных иммунных сывороток при иммунизации животных-продуцентов различ- ными антигенами.

Известен способ получения диагностической туляремийной сыворотки, заключающийся в многократной внутривенной гипериммунизации лошадей-продуцентов корпускулярным бактериальным антигеном [1] .

Известен способ получения диагностической бруцеллезной агглютинирующей сыворотки, заключающийся в иммунизации кроликов-продуцентов живыми вирулентными клетками Br. abortus 146 и Br. melitensis 565 (1.10⁹ м. к. в 1 мл) четырехкратно. Первые три инъекции антигена в объеме 0,5; 0,75 и 1,0 мл (в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда) вводят подкожно в несколько точек вдоль позвоночника, четвертую (1 мл) - внутривенно. Интервалы между первой и второй, второй и третьей инъекциями составляют одну, между третьей и четвертой - две-три недели. Животных тотально обескровливают через две недели после заключительной инъекции антигена. Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая имеет титр не ниже 1: 1600 [2] .

Известен также способ получения иммунных сывороток для тест-системы диагностической к возбудителям зоонозов: чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии, сибирской язвы непрямым иммунофлуоресцентным методом. Кроликов массой 2,5-3 кг иммунизируют внутрикожно многоточечно вдоль спины смесью антигенов возбудителей чумы (0,2 мг), сапа (1 мг), мелиоидоза (1 мг), бруцеллеза (3 мг), туляремии (3 мг) с адъювантом Фрейнда гипериммунизация состоит из 4-5 инъекций с интервалами в 6 дней. Через 30 дней проводят второй цикл гипериммунизации по вышеуказанной схеме. На 7-й день животных кровопускают. Активность сывороток в непрямой реакции иммунофлуоресценции (РНИФ) 1: 256 [3] .

Недостатки известных способов заключаются в том, что способы не обеспечивают получения высокоактивных сывороток, трудоемки и длительны во времени. Подготовка лошадей-продуцентов требует затрат большего количества питательных сред, рабочего и биологического времени. При использовании в качестве антигена живой вирулентной культуры возбудителя бруцеллеза необходимо строго соблюдать противоэпидемический режим работы.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения туляремийной диагностической сыворотки. Лошадей-продуцентов гипериммунизируют культурой туляремийного микроба, убитой кипячением. Гипериммунизацию проводят циклами, состоящими из 5-6 внутривенных инъекций в возрастающих дозах с пятидневными интервалами. Таких инъекций проводят до 17 и более.

Недостатки известного способа: требуется 2,5-3 года кропотливой работы, прежде чем удается получить нужного титра сыворотку (1: 3200).

Целью изобретения является уменьшение сроков подготовки животных-продуцентов и повышение специфической активности целевого продукта.

Цель достигается тем, что животных иммунизируют антигенами в лимфоузлы и внутримышечно раствором феракрила, берут кровь, выделяют сыворотку, добавляют антиген, получают комплекс антиген-антитело и проводят цикл внутри венных инъекций.

П р и м е р 1. Получение туляремийной диагностической сыворотки. Лошадям-продуцентам вводят подкожно в область нижней трети шеи по 2 мл 3% водно-спиртового раствора феракрила. На 5-7-й день вводят по 300 млрд м. к. инактивированной формалином культуры туляремийного микроба в предлопаточные лимфатические узлы в смеси с 2 мл 1 % -ного раствора феракрила. Через 3 дня такую же смесь вводят внутримышечно в увеличивающихся дозах (400, 500, 600, 700 млрд. м. к. ) с промежутком в 4 дня. На 7-8-й день после введения последней инъекции антигена берут пробу крови, получают сыворотку и определяют титр антител. Если титр антител ниже 1: 3200, делают стимулирующее кровопускание 2-3 л. Получают иммунную сыворотку. Берут четыре порции сыворотки по 100 мл, из них в каждую добавляют антиген - инактивированную культуру туляремийного микроба в вышеуказанных возрастающих дозах и назначают второй цикл иммунизации из четырех внутривенных инъекций с 4-дневными интервалами комплекса антиген-антител (АГ-АТ).

На 7-8-й день берут пробу крови, получают иммунную сыворотку и определяют титр антител. Он бывает достаточным (1: 3200) для производственного кровопускания. Таким образом, срок подготовки лошадей-продуцентов сокращается с 3 лет до 2-3 месяцев.

П р и м е р 2. Получение диагностической бруцеллюлозной агглютинирующей сыворотки.

Кроликам-продуцентам массой 2,5-3 кг вводят по 0,6 мл 3% -ного водно-спиртового раствора феракрила в подушечки задних лап. На 5-7-й день липополисахаридный антиген (ЛПС) Br. melitensis 16М в количестве 1 мг смешивают с 1,2 мл 1% водно-спиртового раствора феракрила и по 0,6 мл вводят в подколенные лимфатические узлы. Через три дня такую же смесь вводят внутримышечно трехкратно с промежутками в 4 дня. На 30 день от животных получают по 4 мл иммунной сыворотки, добавляют в нее 4 мг Br. melitensis 16М, растворенного 1 мл ЛПС 0,9% -ного хлорида натрия. Получают комплекс АГ-АТ и вводят четырехкратно по 1 мл с промежутками в 3-4 дня внутривенно тому же животному, от которого получена иммунная сыворотка. На 7-8 день животных кровопускают. Активность сывороток в РИД 1: 32, в ИФА - 1: 7.10⁶, в объемной реакции агглютинации 1: 2560 - 1: 5120.

П р и м е р 3. Получение сыворотки для тест-системы диагностической к возбудителям чумы, сапа, мелиоидоза, бруцеллеза, туляремии.

Все операции, связанные с иммунизацией кроликов-продуцентов, выполняются в той же последовательности, что и при получении бруцеллезной агглютинирующей сыворотки. Антигены возбудителей инъеци- руют в комплексе в следующих дозах: чумы 0,2 мг, сапа 1 мг, мелиоидоза 1 мг, бруцеллеза 3 мг, туляремии 3 мг. Для формирования комплекса АГ-АТ используют половинные дозы. Активность сыворотки для тест-системы в РНИФ 1: 512 - 1: 2048.

Преимущества предлагаемого способа: получение высокоактивных сывороток; сокращение сроков подготовки продуцентов; не требуется строгого соблюдения противоэпидемического режима работы с животными, так как при иммунизации используют инактивированные антигены. (56) Сыворотка диагностическая туляремийная сухая для РА. Регламент производства ФС 42-112ВС-88. Иркутский научно-исследовательский противочумный институт.

Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая сухая. Регламент производства. Одесское предприятие бакпрепаратов.

Инструкция по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для обнаружения возбудителей чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы непрямым иммунофлуоресцентным методом. Научно-исследовательский противочумный институт Кавказа и Закавказья.

Использование: биотехнология, диагностика, иммунная сыворотка, туляремия, бруцеллез, чума, сап, мелиондоза. Сущность изобретения: способ включает иммунизацию животных бактериальными антигенами в лимфоузлы и внутримышечно с раствором феракрила с последующим взятием крови, выделением иммунной сыворотки, формированием комплекса антиген - антитело и внутривенной иммунизацией этим комплексом. Срок подготовки лощадей - продуцентов туляремийной диагностической сыворотки сокращается с 2,5-3 лет до 2-3 мес. При подготовке кроликов - продуцентов бруцеллезной агглютинирующей сыворотки используются инактивированные антигены, а не живые вирулентные культуры возбудителей бруцеллеза, что исключает необходимость строгого соблюдения противоэпидемического режима. Сыворотки, полученные по предлагаемому способу, могут быть использованы для получения меченых гамма-глобулинов.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ преимущественно против зоонозов, включающий иммунизацию животных антигенным материалом, забор крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что животных иммунизируют в лимфоузлы и внутримышечно, при этом используют антиген в смеси с раствором феракрила, в отделенную сыворотку добавляют антиген, используемый для иммунизации, полученной смесью проводят повторную внутривенную иммунизацию, забирают кровь и отделяют целевой продукт.