СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к микробиологии, и касается лабораторной диагностики особо опасных инфекций.

Известны различные способы получения диагностикумов с использованием искусственных носителей.

Методика получения латексного диагностикума на основе моноклональных антител (МКАТ) к V. cholerae серогруппы 01 с чувствительностью 5˙10⁶-1˙10⁷ КОЕ/мл сложна и требует дополнительного применения дорогостоящего оборудования и химреактивов.

Известен также диагностикум с полимерными микросферами диаметром 4-5 мкм в качестве носителей, ковалентно связанными с иммуноглобулинами из чумных коммерческих агглютинирующих сывороток. Активность диагностикума с типичными штаммами возбудителя чумы, выращенными при 37^оС составила 3˙ 10⁵ м. т. /мл, но чувствительность по отношению к микроорганизму, культивированному при 28^оС значительно ниже - 5 ˙10⁷ м. т. /мл.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения антительного диагностикума, в котором в качестве носителя использована суспензия полиакролеинового латекса с диаметром сфер 1,8 мкм, активированная казеином и танином. Латексные частицы сенсибилизировали иммуноглобулинами чумной сыворотки в соотношении 0,15 мг иммуноглобулина на 50 мг носителя, экспозиция 3 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Затем сенсибилизированную суспензию осаждали и дважды промывали 0,15 М раствором NaCl. Отмытую сенсибилизированную суспензию полиакролеинового носителя диспергировали в 1 мл 5% -ного желатоза 5% -ной сахарозной среды, разливали по 0,2 мл в ампулы и лиофильно высушивали. Лиофилизированное содержимое ампулы суспендировали в 4 мл 0,05 М ФСБ рН 7,2 и использовали для постановки реакции агглютинации латекса.

Была отмечена высокая специфичность и чувствительность полученного диагностикума. Однако, при необходимости резкого увеличения объема работы по обнаружению неизвестного возбудителя опасных инфекций бактериальной природы, например в условиях эпидотряда, коммерческие иммуноглобулиновые монодиагностикумы мало пригодны. Каждую поступившую пробу необходимо исследовать по крайней мере с четырьмя различными препаратами, что очень громоздко и неприемлемо, особенно в полевых условиях.

Предлагаемый полигрупповой латексный диагностикум в четыре раза сокращает количество анализов и значительно экономит бакпрепараты.

Целью изобретения является способ получения полигруппового иммуноглобулинового диагностикума к пяти видам возбудителей особо опасных бактериальных инфекций, позволяющий увеличить количество адсорбированных иммуноглобулинов на единице носителя и сократить время анализа при использовании полученного диагностикума.

Поставленная цель достигается тем, что получают полигрупповую сыворотку путем одновременной иммунизации кроликов смесью антигенов возбудителей чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии и бруцеллеза в соотношении 0,1: 1: 1: 6: 4. Иммуноглобулины из сывороток выделяют каприловой кислотой по известной методике. Полиакролеиновые частицы с микросфер 1,8 мкм сенсибилизируют иммуноглобулинами полигрупповой сыворотки по следующей методике. Приливают в бюкс равные объемы 1,25% -ной латексной суспензии и взвеси иммуноглобулинов с концентрацией белка 50-100 мкг/мл и перемешивают на магнитной мешалке при температуре 20-23^оС в течение 4 ч. Затем этот процесс продолжают при температуре 4-5^оС 12 ч. Смесь отмывают 0,15 М раствором ФСБ и осадок ресуспендируют в 1 мл среды высушивания, состоящей из смеси 2% -ного раствора бычьего сывороточного альбумина и 5% -ного раствора сахарозы. Диагностикум разливают в ампулы по 0,5 мл и лиофильно высушивают. Перед постановкой реакции агглютинации латекса содержимое ампулы растворяют в 5 мл 0,05 М ФСБ рН 7,2.

Таким образом, применение предложенной совокупности приемов (получение полигрупповой сыворотки, сенсибилизация латекса полигрупповыми иммуноглобулинами) позволило придать способу новое качество - получить полигрупповой диагностикум, который позволяет обнаруживать любой из пяти бактериальных возбудителей особо опасных инфекций в загрязненных пробах, что значительно сокращает время и объем проводимого анализа и дает возможность повысить сорбционную емкость носителя.

П р и м е р 1. Готовят забуференный 0,15 М раствор NaCl pH 7,2 и используют его в качестве разводящей жидкости. 1 мл 1,25% -ной суспензии полиакролеинового латекса приливают к 1 мл взвеси полигрупповых иммуноглобулинов с концентрацией белка 100 мкг/мл и перемешивают на магнитной мешалке при 20^оС в течение 4 ч. Затем перемешивание продолжается при 4^оС 12 ч. Сенсибилизированный латекс осаждают центрифугированием при 3 тыс. об. /мин, отмывают 0,05 М раствором ФСБ и осадок ресуспендируем в 10 мл этого же раствора. С полученным диагностикумом ставят реакцию агглютинации латекса. Контроли: 1) диагностикум с разводящей жидкостью; 2) диагностикум с взвесью гетерологичных микроорганизмов. Наблюдают положительную реакцию (зонтики) в лунках, где содержатся возбудители чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии бруцеллеза в концентрации ≥6˙10⁵ м. т. /мл. В контролях-компактные диски на дне лунок.

П р и м е р 2. Сенсибилизация как в примере 1, но в качестве разводящей жидкости используют забуференный 0,15 М раствор NaCl pH - 7,0. При постановке реакции агглютинации латекса наблюдают широкие "пуговки" на дне лунок в контролях, т. е. результат сомнительный.

П р и м е р 3. Сенсибилизация латекса как в примере 1, но рН разводящей жидкости 7,4. Полученный диагностикум в контролях дает нечетко очерченные диски на мутном фоне, т. е. результат сомнительный.

П р и м е р 4. Готовят 4 диагностикума с концентрациями белка 50 и 100 мкг/мл (1 пара) и 50 и 100 мкг/мл (2 пара), как в примере 1, причем первые 2 сенсибилизируют только 4 ч, а два других дополнительно по 12 ч при 4^оС.

С полученными диагностикумами ставят реакции агглютинации латекса, используя взвеси убитых микроорганизмов.

Результаты РАЛ приведены в таблице.

Таким образом, как видно из таблицы, увеличение нагрузки глобулинов на единицу носителя приводит к спонтанной агглютинации в контролях, что препятствует получению полигруппового диагностикума известным способом, а предлагаемый способ позволяет достичь указанную цель.

П р и м е р 5. Для исследования поступило 20 проб полевого материала, подозреваемого на зараженность возбудителями бактериальных особо опасных инфекций. Анализ проведен с помощью коммерческих монодиагностикумов чумного, сапного, мелиоидозного, туляремийного, бруцеллезного. Всего поставлено 80 реакций. Параллельно исследовали поступившие пробы диагностикумом полигрупповым латексным. Проведено 20 анализов. Результаты по всем пробам получены в первом случае через 6 ч (из расчета 3 мин на 1 анализ и 2 ч на получение четких результатов), с использованием полигруппового диагностикума 3 ч. Затрачено 24 мл (6 мл х 4) монодиагностикумов и 6 мл полигруппового диагностикума соответственно в 1-м и 2-м случаях.

Как видно по результатам, сэкономлены время, диагностические препараты, планшеты, снижены трудозатраты на исследование проб. Причем, эффект от применения полигруппового латексного диагностикума будет возрастать с увеличением количества поступивших для анализа проб.

Таким образом, благодаря предлагаемому способу удалось получить полигрупповой диагностикум, позволяющий сократить в 2 раза время анализа, в 4 раза сократить объем расхода препаратов относительно прототипа и увеличить глобулиновую нагрузку на единицу носителя.

(56) Авторское свидетельство СССР N 1596926, кл. G 01 N 33/53, 1989.

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к микробиологии. Целью является повышение информативности диагностикума и сорбционной емкости латекса. Поставленная цель достигается тем, что получают полигрупповую сыворотку путем одновременной иммунизации кроликов смесью антигенов возбудителей чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии и бруцеллеза в соотношении 0,1 : 1 : 1 : 6 : 4, в качестве сенситина использованы иммуноглобулины из полигрупповой сыворотки. Сенсибилизацию латексов проводили при соотношении 10 мг носителя на 0,1 мг глобулинов, при PH - 7,0 - 7,4, в течение 4 ч при комнатной температуре, затем 12 ч при 4С при постоянном равномерном перемешивании. Способ обеспечивает увеличение глобулиновой нагрузки на единицу носителя и позволяет сократить как минимум в 2 раза время анализа, в 4 раза снизить расходы препаратов относительно прототипа при использовании полученного диагностикума. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА путем сенсибилизации полиакролеинового латекса иммуноглобулинами чумной сыворотки, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности диагностикума и повышения сорбционной емкости латексных частиц, сенсибилизацию осуществляют иммуноглобулинами антисыворотки, содержащей дополнительно иммуноглобулины к сапу, мелиоидозу, туляремии и бруцеллезу и полученной при иммунизации кроликов соответствующими антителами в соотношении 0,1 : 1 : 1 : 6 : 4, причем при сенсибилизации берут 0,1 мг глобулинов на 10 мг частиц латекса, ингибируют при рН 7,0 - 7,4 в течение 4 ч в комнатной температуре и 12 ч при 4^oС при постоянном равномерном перемешивании.