СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/40 C07K16/12 A61K39/39 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток при снижении трудоемкости и отхода животных-продуцентов.

Известен способ получения диагностической бруцеллезной агглютинирующей сыворотки, заключающийся в иммунизации кроликов-продуцентов живыми вирулентными клетками Br.abortus 146 и Br.melitensis 565 четырехкратно, три раза через 1 неделю, 4-й раз через 2-3 недели, тотальном обескровливании через 2 недели после заключительной инъекции, причем первые три инъекции проводят в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Сыворотка имеет титр не ниже 1:1600.

[Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая сухая. Регламент производства N 273-82. Одесское предприятие бакпрепаратов].

При использовании живой вирулентной культуры необходим строгий противоэпидемический режим, сыворотка недостаточно активна, способ трудоемок, длителен.

Известен способ получения иммунных сывороток для тест-системы диагностической иммунофлуоресцентной (непрямой метод) к возбудителям зоонозов: чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы [Тюменцева И.С. "Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций". Автореферат дисс. на соискание уч.ст. доктора мед.наук, Саратов, 1996]. Схема иммунизации по этому способу включает последовательные многоточечные внутрикожные введения смеси антигенов с полным адъювантом Фрейнда. Гипериммунизация включает четыре инъекции с интервалом в шесть дней, месячный перерыв и еще четыре инъекции с шестидневным интервалом. Иммунный ответ с производственными титрами сывороток (1:256 - 1:512), определяемыми в НРИФ, отмечается лишь у 25-30% иммунизируемых кроликов по причине неравнозначного иммунного ответа на отдельные антигенные компоненты, кроме того у животных развивается адъювантная болезнь.

Способ длителен и трудоемок.

Известен способ получения диагностической видоспецифической чумной сыворотки [Дертева И.И. и др. Сб.научных работ в противочумных учреждениях. - Саратов, 1966, с. 151-162]. Иммунизация животных-продуцентов осуществляется тремя курсами с двухнедельными перерывами между ними. В первые два курса инъекции проводят 3-кратно через 4 суток, в третьем курсе 6 инъекций через 4 суток. В каждом курсе дозы антигена увеличивают с каждой инъекцией. Животных обескровливают на 7-9 сутки после последней инъекции.

Агглютинационные титры сыворотки 1:50-1:200. Сыворотка малоспецифична, способ ее получения очень длителен и трудоемок.

Известен способ получения сыворотки для производства сибиреязвенных споровых люминесцирующих иммуноглобулинов [Сыворотка диагностическая сибиреязвенная споровая люминесцирующая адсорбированная сухая. Регламент производства N 156-80 СНИПЧИ].

По этому способу иммунизацию кроликов осуществляют авирулентными спорами Bac. anthracis 10-кратно с 3-х дневными интервалами, 5 инъекций подкожно, 5 внутривенно с увеличением дозы микробов. Через 7 дней после последней инъекции проводят обескровливание и приготовление сыворотки. Производственный титр в НРИФ достигает 1:3200.

Сыворотка недостаточно активна.

Таким образом, все известные способы получения диагностических моно- и поливалентных сывороток имеют общие недостатки, заключающиеся в недостаточной активности получаемых сывороток, трудоемкости процесса их получения, низком выходе целевого продукта, обусловленном высокими отходами животных продуцентов, что не обеспечивает возможности организации массового производства диагностических препаратов.

Наиболее близким по существу и назначению к заявленному способу является способ получения диагностических зоонозных сывороток [Патент РФ N 2010577, A 61 K 39/40, от 15.04.94 г., Бюл. N 7]. Схема иммунизации животных-продуцентов включает внутримышечное введение водно-спиртового раствора феракрила, на 5-7-й день введения в лимфоузлы смеси авирулентного антигена с феракрилом с последующей трехкратной иммунизацией этой смесью с промежутками в 4 дня внутримышечно, получение на 30-й день иммунной сыворотки, смешивание ее с антигенным материалом и последующую четырехкратную иммунизацию тех же животных комплексом Аг-Ат с промежутками в 3-4 дня внутривенно, кровопускание на 7-8-й день после последней инъекции. Специфическая активность полученных по этому способу гипериммунных сывороток в НРИФ достигает 1:512-1:2048. Количество антителообразующих кроликов-продуцентов с подобными титрами составляет 95%. Недостатком прототипа является недостаточно высокая специфическая активность сывороток, длительность процесса иммунизации (49-54 дня).

Целью изобретения является повышение специфической активности диагностических сывороток, упрощение и снижение трудоемкости процесса их получения при высоком выходе целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что животных-продуцентов пятикратно иммунизируют авирулентным антигенным материалом внутривенно, одновременно вводят внутримышечно в качестве иммуномодулятора тималин, в третью инъекцию дополнительно внутримышечно вводят циклофосфан, отделяют кровь и приготавливают сыворотку.

По отношению к прототипу заявляемый способ получения диагностической сыворотки имеет следующие отличительные признаки. Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствует значительному повышению титров специфических сывороточных антител за счет увеличения числа антителообразующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелперных T-клеток. Циклофосфан, являясь классическим иммуносупрессором, также активизирует магрофаги, стимулируя фагоцитарную, цитотоксическую и супрессивную (в отношении главным образом T-лимфоцитов) функции [Лазарева Д.Н., Алехин Е.Н. Стимуляторы иммунитета. М.: Медицина, 1985, с. 67-70, 147-150]. Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммуносупрессора - с другой, служат оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других.

Возможность практического использования предлагаемого способа иллюстрируется примерами изготовления сывороток с использованием полной совокупности заявляемых признаков изобретения.

Пример 1. Получение чумной диагностической сыворотки. Кроликам-продуцентам вводят внутривенно каждые четыре дня пятикратно фракцию 1 чумного микроба в увеличивающихся дозах: 0,1 мг; 0,15 мг; 0,2 мг; 0,25 мг; 0,3 мг. В эти же сроки внутримышечно инъецируют по 5 мг тималина, а в третью инъекцию дополнительно внутримышечно вводят 100 мг циклофосфана. На 7-й день животных кровопускают. Активность сывороток в РНИФ достигает 1:16384 и выше, при этом сыворотки отличаются высокой специфичностью.

Пример 2. Получение диагностической бруцеллезной сыворотки. Кроликам-продуцентам вводят внутрибрюшинно каждые четыре дня пятикратно водорастворимый полигрупповой антиген из B.abortus 19, B.melitensis Rev-I, B.suis 61 в увеличивающихся дозах: 1 мг; 1,25 мг; 1,5 мг; 1,75 мг; 2 мг. В эти же сроки внутримышечно инъецируют по 5 мг тималина, а в третью инъекцию дополнительно внутримышечно вводят 100 мг циклофосфана. Активность сывороток в РНИФ достигает 1:16384 и выше.

Пример 3. Получение диагностической сибиреязвенной антиспоровой сыворотки. Все операции, связанные с иммунизацией кроликов-продуцентов, выполняются в той же последовательности, что и при получении диагностической бруцеллезной сыворотки. Водорастворимый антиген получают из спор штамма Bac. anthracis I CO, обработанных автоклавированием при 1,5 атм в течение 2 часов. Активность сывороток в РНИФ 1:16384-1:32768.

Пример 4. Получение диагностической полигрупповой чумной, туляремийной, бруцеллезной, сапной, мелиоидозной сыворотки.

Все операции, связанные с иммунизацией кроликов-продуцентов, выполняются в той же последовательности, что и при получении диагностической бруцеллезной сыворотки. Антигены возбудителей инъецируют в комплексе в следующих дозах: чумы - 0,1 мг; 0,15 мг; 0,25 мг; 0,3 мг, а антигены туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза - по 1 мг; 1,25 мг; 1,5 мг; 1,75 мг; 2 мг. Активность сывороток в РНИФ достигает 1:16384 и выше по каждому составляющему компоненту.

Пример 5. Получение полигрупповой дизентерийной диагностической сыворотки. Водорастворимый полигрупповой антиген получают из типичных для каждого вида шигеллезных штаммов (Sh.dysenteriae, Sh.flexneri, Sh.boydii и Sh. sonnei) и инъецируют в той же последовательности и тех же дозах, что и при получении диагностической бруцеллезной сыворотки. Активность сывороток в РНИФ достигает 1:16384 и выше.

Пример 6. Получение трепонемной диагностической сыворотки. Водорастворимый трепонемный ультраозвученный антиген инъецируют в той же последовательности и тех же дозах, что и при получении диагностической бруцеллезной сыворотки. Активность сыворотки в НРИФ достигает 1:16384 и выше.

Таким образом, изобретение практически осуществимо.

При сопоставлении со способом-прототипом выявлены следующие преимущества: значительное сокращение длительности процесса иммунизации с 49-54 до 27-30 дней за счет исключения этапа подготовки животных к иммунизации и одновременных инъекций антигена и иммуномодуляторов, повышение выхода целевого продукта за счет увеличения антителообразования у животных продуцентов и уменьшения расхода антигенных материалов, значительное повышение специфической активности сывороток в НРИФ с 1:512 - 1:2048 до 1:16384 - 1:32768. Использование изобретения в биотехнологии позволит организовать массовый выпуск высокоактивных, специфичных сывороток для производства диагностических препаратов.

Изобретение предназначено для производства высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток. Животных-продуцентов пятикратно иммунизируют авирулентным антигенным материалом внутривенно. Одновременно вводят внутримышечно в качестве иммуномодулятора тималин. В третьей инъекции антигена внутримышечно вводят иммуномодулятор циклофосфан. Отделяют кровь и приготавливают сыворотку. Изобретение повышает специфическую активность диагностических сывороток, упрощает и снижает трудоемкость процесса их получения при высоком выходе целевого продукта.

Способ получения диагностической сыворотки, включающий многократную иммунизацию животных-продуцентов авирулентным антигенным материалом в совокупности с иммуномодуляторами, забор крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что в качестве иммуномодуляторов используют тималин и циклофосфан, иммунизацию осуществляют пятикратно, антигенный материал вводят внутривенно, иммуномодулятор тималин - внутримышечно одновременно с инъекцией антигена, при этом циклофосфан вводят однократно с третьей инъекцией.