СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ФОСФОРИЛХОЛИНУ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения белков, специфичных к фосфорилхолину (ФХ): С-реактивного белка (СРБ), антител к фосфорилхолину, фосфолипазы С- α -токсина Cl. perfringens типа А (ФЛС) и соответствующей антифосфолипазы С- α -антитоксина (антиФЛС).

Известен полуколичественный способ определения СРБ путем взаимодействия исследуемой пробы с антителами к СРБ в капилляре.

Известен способ определения СРБ путем твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на планшете, модифицированном ФХ, конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином (БСА), с последующей обработкой специфическим субстратом (прототип). Способ включает длительный (до 12 дней) и дорогостоящий 5-этапный синтез, требующий использования водорастворимых карбодиимидов импортного производства.

Известен способ определения антител к ФХ в твердофазном ИФА, связанный с использованием для модификации планшета фосфатидилхолина, растворенного в смеси хлороформа и метилового спирта. Данный способ требует значительных количеств ингредиентов и недостаточно специфичен.

Известен способ определения ФЛС в реакции нейтрализации токсина in vivo и in vitro. При определении микроколичеств ФЛС в крови с диагностической целью чувствительности этого способа недостаточно.

Известен способ определения антиФЛС в твердофазном ИФА с использованием планшета, модифицированного анатоксином El. perfringens типа А, который требует применения серологически чистого анатоксина, получение которого связано с большой сложностью: требуется получить культуральную жидкость микроорганизма, содержащую ФЛС, очистить ФЛС, провести ее детоксикацию и затем очистить полученный таким образом анатоксин.

Целью изобретения является унификация и упрощение способа определения белков, специфических к фосфорилхолину.

Это достигается тем, что в способе, предусматривающем проведение твердофазного ИФА на планшете, в качестве модификатора планшета используют смесь лизолецитина и гликозилдиглицерида при соотношении 1:1,5.

Предлагаемый способ определения белков, специфичных к фосфорилхолину, позволяет повысить по сравнению с аналогом чувствительность определения СРБ в 18-20 тыс. раз. Способ по сравнению с прототипом при той же чувствительности (10 нг/мл) значительно проще, так как исключает необходимость синтеза ФХ с БСА и основан на использовании ингредиентов отечественного производства.

Чувствительность определения ФЛС превышает чувствительность аналога в 50 раз и антиФЛС - в 150 ра. Помимо того, исключается необходимость изготовления экспериментального препарата α-анатоксина Cl. perfringens типа А.

Определение СРБ осуществляют следующим образом. Перед употреблением планшет промывают раствором 1, содержащим в 100 мл дистиллированной воды 0,85 г хлористого натрия и 1 мл 10%-ного раствора хлористого кальция, pH 7,3 ± 0,1, и жидкость из его лунок удаляют встряхиванием планшета. Затем в лунки вносят по 200 мкл исследуемых сывороток, разведенных в отношении 1: 500, а в контрольный ряд - стандартный образец СРБ от 0,8 до 267,0 нг/мл в растворе 2, содержащем в 200 мл дистиллированной воды 1,7 г хлористого натрия, 2 мл 10%-ного раствора хлористого кальция и 500 мг БСА, pH 7,3± 0,1.

Планшет оставляют при температуре (20 ± 2)^оС на 18-24 ч для образования комплекса СРБ-ФХ, после чего отмывают 5 раз с интервалом 5 мин раствором 3, содержащим в 500 мл дистиллированой воды 4,25 г хлористого натрия, 5 мл 10% -ного раствора хлористого кальция, 0,5 мл твина-80, pH 7,3± 0,1. После отмывания планшета в каждую лунку вносят по 200 мкл кроличьей сыворотки к СРБ, разведенной до 1:1000 раствором 3. Планшет оставляют при температуре (37 ± 1)^оС на 1 ч, после чего его отмывают как описано выше. Затем в каждую лунку планшета вносят по 200 мкл козьих антител против IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой и разведенных раствором 3. Планшет оставляют при температуре (37± 1)^оС на 1 ч, после чего отмывают раствором 3 как указано выше. В лунки отмытого планшета добавляют по 200 мкл субстрат-индикаторной смеси, приготовленной следующим образом: 15 мг 5-аминосалициловой кислоты растворяют в 20 мл дистиллированной воды, нагретой до температуры (70 ± 3)^оС, раствор фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,0 0,05, затем в готовый раствор добавляют 2,3 мл раствора перекиси водорода, разведенной непосредственно перед опытом из расчета 0,1 мл 33%-ной перекиси в 60 мл дистиллированной воды. Планшет оставляют с субстрат-индикаторной смесью при температуре (20 ± 2)^оС на 25-40 мин в темноте. Интенсивность окрашивания регистрируют на Multiscan при длине волны 450 нм.

Содержание СРБ рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному образцу СРБ.

Определение антител к фосфорилхолину осуществляют следующим образом. Планшет промывают раствором 1, содержащим в 100 мл дистиллированной воды 0,85 г хлористого натрия, pH 7,3 ± 0,1. Жидкость из планшета удаляют встряхиванием и затем вносят по 200 мкл контрольных (положительная и отрицательная) и исследуемых сывороток человека, разведенных при соотношении 1: 100 и 1:500 раствором 2, содержащим в 100 мл дистиллированной воды 0,85 г хлористого натрия и 250 мг БСА, pH 7,3 ±0,1. Планшет выдерживают при температуре (37 ± 1)^оС в течение 1 ч для образования комплекса антитело-ФХ. Затем все исследуемые образцы удаляют и планшет отмывают 5 раз с интервалом 5 мин раствором 3, содержащим в 500 мл дистиллированной воды 4,25 г хлористого натрия и 0,5 мл твина-80, pH 7,3 ± 0,1. В лунки планшета вносят по 200 мкл раствора антител кроличьих против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой и разведенных в том же растворе. Планшет выдерживают при температуре (37 ± 1)^оС в течение 1 ч, отмывают раствором 3 и в каждую лунку добавляют по 200 мкл субстрат-индикаторной смеси. Приготовление ее и последующие процедуры выполняют как указано выше.

Результат рассчитывают по разнице в показаниях экстинкции при анализе как контрольных сывороток, разведенных при соотношении 1:100 и 1:500, так и исследуемых, разведенных таким же образом.

Определение фосфолипазы С осуществляют следующим образом. Планшет промывают раствором 1, содержащим в 100 мл дистиллированной воды 0,85 г хлористого натрия, 1 мл 10%-ного раствора хлористого кальция, pH 7,3 ± 0,1. Жидкость из лунок удаляют встряхиванием планшета. Затем в лунки его вносят по 200 мкл раствора ФЛС, содержащего от 1 до 25 лецитиназных единиц в мл, а также исследуемые сыворотки, содержащие ФЛС, в разведениях 1:100 и 1:500. Используют для этого раствор 2, содержащий в 100 мл дистиллированной воды 0,85 г хлористого натрия, 1 мл 10%-ного раствора хлористого кальция и 250 мг БСА, pH 7,3 ± 0,1. Планшет оставляют на 18-24 ч при температуре (20 ± 2)^оС для образования комплекса ФЛС-ФХ, затем его отмывают 5 раз с интервалом 5 мин раствором 3, содержащим в 500 мл дистиллированной воды 4,25 г хлористого натрия, 5 мл 10% -ного раствора хлористого кальция и 0,5 мл твина-80, pH 7,3 ± 0,1. Затем в лунки планшета вносят по 200 мкл раствора гипериммуной кроличьей антисыворотки, содержащей 12-16 МЕ антитоксина Cl. perfringens типа А, разведенной при соотношении 1:1000 раствором 3. Планшет инкубируют при температуре (37 ± 1)^оС в течение 1 ч, затем отмывают как указано ранее и в лунки вносят по 200 мкл антител козьих против IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой. Икубируют при температуре (37 ±1)^оС в течение 1 ч, отмывают раствором 3 как указано ранее и в лунки добавляют по 200 мкл субстрат-индикаторной смеси. Приготовление ее и последующие процедуры - как описано выше. Активность ФЛС рассчитывают по калибровочному графику.

Определение антифосфолипазы С осуществляют следующим образом.

Планшет промывают раствором 1, содержащим в 100 мл дистиллированной воды 0,85 г хлористого натрия, pH 7,3 ± 0,1. Жидкость из лунок удаляют встряхиванием планшета. В лунки его вносят по 200 мкл первичного концентрата ФЛС, содержащего 0,25 мг/мл и разведенного раствором 3, содержащим в 100 мл дистиллированной воды 0,85 г хлористого натрия, 1 мл 10%-ного раствора хлористого кальция, pH 7,3 ± 0,1. Планшет выдерживают при температуре (20 ± 2)^оС в течение 18-24 ч для образования комплекса ФЛС-ФХ. Затем содержимое лунок удаляют, планшет промывают 5 раз с интервалом 5 мин и в лунки его вносят по 200 мкл контрольной сыворотки, содержащей 1 МЕ антитоксина Cl. perfringens типа А и разведенной от 1:500 до 1:25000 раствором 3, содержащим в 500 мл 4,25 г хлористого натрия, 5 мл 10%-ного раствора хлористого кальция, 0,5 мл твина-80, pH 7,3 ± 0,1, а также исследуемые сыворотки, разведенные при соотношении 1:1000. Планшет инкубируют при температуре (37 ± 1)^оС, а затем отмывают раствором 3 как описано ранее и в лунки планшета добавляют по 200 мкл антител кроличьих против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой. Планшет инкубируют при температуре (37 ± 1)^оС в течение 1 ч, отмывают раствором 3 как указано выше и в лунки добавляют по 200 мкл субстрат-индикаторной смеси. Приготовление ее и последующие процедуры - как указано выше. Титр сывороток устанавливают по калибровочному графику.

Использование: в медицине для количественного определения белков, специфичных к фосфорилхолину: C-реактивного белка (СРБ), антител к фосфорилхолину (ФХ), фосфолипазы C ( α - токсина) Cl.perfringens. (ФЛС) и соответствующей антифосфолипазы C ( a -антитоксина). Сущность изобретения: планшеты обрабатывают смесью лизофосфатидилхолина и гликозилглицерида при соотношении 1 : 1,5 с последующим иммуноферментным определением белков, специфичных к фосфорилхолину.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ФОСФОРИЛХОЛИНУ, включающий обработку планшета с последующим проведением иммуноферментного анализа и регистрацией результатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, планшет обрабатывают смесью лизофосфатидилхолина и гликозидилдиглицерином в соотношении 1 : 1,5.