КОНЬЮГАТ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА И СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам проведения иммуноферментного анализа и веществам, используемым для этих целей.

В настоящее время для определения наличия и содержания антител или антигенов в биологических жидкостях широко используется иммуноферментный анализ (ИФА).

Недостатками существующих методов являются, как правило, относительно невысокая чувствительность, сложная технология анализа, высокая стоимость.

Используемые конъюгаты представляют собой соединения общей формулы М-А, где М - маркер, А - биоспецифический реагент (антиген, антитело, биотин, авидин, пептиды, олигонуклеотиды и т.п.). Компоненты связаны между собой ковалентной или ионной связью. Наиболее широко применяются конъюгаты, где в качестве маркера используется щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пирофосфатаза, пероксидаза хрена и ряд других. Недостатками обычно используемых конъюгатов являются нестандартность, труднодоступность, сложность проведения цветных реакций и т.п.

Прототипом предлагаемого является способ ИФА с использованием в качестве конъюгата препарата, содержащего в качестве маркерной части пероксидазу хрена.

Ферментный препарат пероксидазы хрена получают из корневищ хрена следующими операциями: сбор и очистка корневищ, измельчение их и отжим сока. Осаждение фермента из сока и последующая его очистка методами ионообменной хроматографии.

Полученную пероксидазу хрена используют для синтеза конъюгатов в ИФА.

Конъюгат получают окислением углеводной части пероксидазы хрена с образованием альдегидных групп, взаимодействующих с аминогруппами антител. Конъюгат стабилизируют восстановлением боргидридом натрия и подвергают дальнейшей очистке.

Иммуноферментный анализ включает в себя обработку твердой фазы раствором, содержащим биоспецифический реагент, отделение непрореагировавшей жидкой фазы, обработку твердой фазы конъюгатсодержащим раствором, разделение твердой и жидкой фаз и анализ одной из них, включающий ее обработку первым и вторым субстратами.

Недостатками используемого конъюгата является нестандартность, обусловленная природой происхождения маркера, трудность его получения, а способа ИФА - относительно низкая точность, связанная с высокой фоновой реакцией, вызванной использованием в качестве второго субстрата перекиси водорода и происходящим вследствие этого неферментативным окислением хромогена, вызывающим искажение конечного результата.

Целью изобретения является разработка более точного и технологичного метода ИФА с использованием более доступного и простого по технологии получения конъюгата.

Нами было найдено, что указанная цель достигается за счет использования в качестве маркерной части конъюгата лакказы, выделенной из Coriolus hirsutus и проведением ИФА по традиционной схеме с использованием в качестве конъюгата препарата, содержащего компоненты лакказы и реагента, способного взаимодействовать с веществом, иммобилизованным на твердой фазе, а в качестве второго субстрата - кислорода воздуха.

Использовалась лакказа - монофенол, дигидроксифенилаланинкислород оксидоредуктаза (КФ 1.14.18.1), полученная из культуральной жидкости базидиального гриба Coriolus hirsutus осаждением сульфатом аммония и последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Степень чистоты препарата по данным электрофоретических исследований свыше 90%. Использование хроматографии на ДЭАЭ-Toyoperl (Toyo Soda Co., Япония) позволяет получить фермент, гомогенный по данным электрофореза в градиентном полиакриламидном геле. При pH 4,5 и t = 50^оС значения констант Михаэлиса и максимальной скорости окисления гидрохинона лакказой остаются неизменными в течение 6 ч. Инкубация фермента при 40^оС в течение 3 сут вызывает снижение активности лишь на 50% от исходной. Молекулярная масса лакказы, определенная различными методами, составляла 55 кД и соответствовала односубъединичной молекуле. Как и большинство голубых оксидаз данный фермент представляет собой гликопротеин, содержащий 17% углеводов по молекулярной массе (определено фенол-серным методом).

С целью получения конъюгата к раствору лакказы добавляют раствор периодата натрия, смесь инкубируют и подвергают диализу. К полученному раствору окисленного фермента добавляют антитела, смесь инкубируют, затем вносят боргидрид натрия, диализуют и очищают на хроматографической колонке. Фракцию, содержащую иммунологическую и ферментативную активности используют для иммуноанализа.

Существенными отличиями заявляемого препарата является использование в его составе в качестве маркера лакказы из различных штаммов грибов: Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolus versicolor и др. Известные лакказы получают из других источников таких, как лаковое дерево и базидиомицеты и применяют в лабораторной практике для создания ферментных электродов.

Существенными отличиями способа являются использование нового конъюгата, а также кислорода в качестве второго субстрата.

Использование совокупности новых существенных признаков позволяет значительно упростить технологию получения маркера и, соответственно, конъюгата, повысить на порядок точность определения, упростить технологию проведения анализа за счет исключения стадии введения перекиси водорода. Способ пригоден для анализа практически любых антигенов и антител.

П р и м е р 1. Выделение лакказы.

Для выделения лакказы использовали фильтрат культуральной жидкости базидиомицета Coriolus hirsutus, выращенного в условиях глубинного культивирования в колбах емкостью 3 л, содержащих по 750 мл питательной среды. Состав питательной среды и условия культивирования поддерживались характерными для роста культуры и образования внеклеточных оксидаз дереворазрушающих грибов из рода Coriolus Quel. Лиофилизацию культурального фильтрата осуществляли на сублимационной установке КС-3000 (ЧССР) при 50 мм рт.ст. и температуре нагрева на кассетах 35-37^оС.

Лиофилизованный фильтрат культуральной жидкости (34 г) растворяли в 200 мл воды и центрифугировали при 2500 g в течение 15 мин. Осадок суспендировали в 100 мл воды и повторно центрифугировали. Далее объединяли надосадочную жидкость после первого и второго центрифугирования, проводили осаждение сульфатом аммония в течение 2 ч и центрифугировали 1 ч при 2500 g. Полученный осадок растворяли в 110 мл воды и диализовали против 5 мМ калий-фосфатного буфера pH 7,2. После диализа препарат наносили на колонку (2х20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой ("Whatman", Англия), уравновешенную 5 мМ калий-фосфатным буфером pH 7,2. Белок элюировали калий-фосфатным буфером с возрастающим линейным градиентом ионной силы от 5 мМ до 0,2 М. Фракции, обладающие ферментативной активностью, объединяли и рехроматографировали на ДЭАЭ-целлюлозе в тех же условиях, но при более пологом градиенте. Дальнейшую очистку препарата проводили гель-хроматографией на колонке (5x100 см) с носителем Toyopearl 55 HW, уравновешенной 5 мМ калий-фосфатным буфером pH 6,5. Белок элюировали тем же буфером.

Из 34 г лиофилизованного фильтрата культуральной жидкости Coriolus hirsutus получено 16,2 мг лакказы с удельной активностью 100 усл.ед./мг белка при 25^оС (активность фермента определяли спектрофотометрически по накоплению о-хинона при длине волны 410 нм в 0,1М калий-ацетатном буфере pH 4,5).

Результаты, полученные на различных стадиях выделения и очистки лакказы, представлены в таблице.

Полученный препарат представлял собой гомогенный фермент по данным электрофореза в градиентном полиакриламидном геле. Молекулярная масса фермента, определенная методами электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и высокоэффективной жидкостной хроматографии, составляла 55 кД. Значение изоэлектрической точки лакказы равно 4,5.

П р и м е р 2. Приготовление конъюгата лакказы с антителами.

К 6 мг лакказы, растворенной в 1 мл воды, добавляют раствор периодата натрия до конечной концентрации 0,12 М. Смесь инкубируют в течение 20 мин и диализуют против 0,01 М ацетатного буфера pH 4,5 при температуре 4^оС. К полученному раствору постепенно добавляют козьи антимышиные антитела, поддерживая значение pH в области 8,8-9,0. Молярное соотношение фермента и антител 2,5:1. Смесь инкубируют 1 ч при комнатной температуре и слабом перемешивании. Далее прибавляют 6 мг боргидрида натрия и инкубируют 2 ч при температуре 4^оС. Смесь диализуют против 5 мМ калий-фосфатного буфера pH 6,8 и очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке TSK-3000SW (Pharmacia LKB Pribori AB, Швеция). Фракцию, содержащую иммунологическую и ферментативную активности собирают и используют для определения антигена.

П р и м е р 3. Приготовление конъюгата лакказы с авидином.

Синтез конъюгата лакказы с авидином проводили по методике, описанной в примере 2. Очистку полученного конъюгата проводили путем его осаждения сульфатом аммония при 60%-ном насыщении с последующим диализом против 0,02 М калий-фосфатного буфера pH 6,5. В отдиализованный препарат добавляли 50% глицерина (по объему) и хранили при -20^оС. Проверку качества препарата проводили методом гетерогенного иммуноферментного анализа, для чего в 96-луночные полистирольные микропланшеты вносили по 100 мкл раствора биотинилированного бычьего сывороточного альбумина в концентрациях от 10 мкг до 10 пкг. Микропланшеты инкубировали в течение ночи при 4^оС, далее микропланшеты промывали буфером. В лунки микропланшета вносили по 200 мкл 0,2%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,01 М натрий-фосфатном буфере pH 7,4, содержащем 0,15 М хлористого натрия и 0,05% Tween-20 (ФСБТ), и инкубировали при 37^оС в течение часа, после чего проводили повторную промывку тем же буфером. В лунки вносили по 100 мкл конъюгата лакказы с авидином с концентрацией 0,6 мкг/мл и инкубировали 40 мин при 37^оС. Микропланшеты снова промывали и вносили в лунки по 100 мкл раствора субстрата. Далее определение концентрации биотинилированного бычьего сывороточного альбумина проводили аналогично определению специфических антител, подробно описанному в примере 4.

П р и м е р 4. Использование иммунолакказного конъюгата для тестирования гибридом.

В лунки полистирольного микропланшета для иммуноферментного анализа вносили по 200 мкл раствора пероксидазы из хрена (10 мкг/мл) в карбонатном буфере pH 9,6 и инкубировали 20 ч при температуре 4^оС. Раствор пероксидазы удаляли, лунки микропланшета промывали ФСБТ. Для насыщения центров сорбции на поверхности полистирола, после сорбции пероксидазы в лунки вносили по 250 мкл раствора овальбумина (10 мг/мл) и инкубировали 2 ч при 37^оС, после чего промывали лунки трехкратно ФБСТ.

Суспензию гибридомных клеток, синтезирующих моноклональные антитела к пероксидазе, полученных путем слияния миеломных клеток линии Sp 210 с иммунными спленоцитами мышей вносили в лунки и инкубировали 1 ч при 37^оС, далее суспензию удаляли и лунки трехкратно промывали ФСБТ. Иммунолакказный конъюгат (концентрация 1 мкг/мл) вносили в лунки по 100 мкл в каждую и инкубировали один час при 37^оС. Конъюгат удаляли, лунки микропланшета промывали и вносили раствор субстрата в количестве 100 мкл в лунку. В качестве субстрата применяли 2,2-азино-ди-этилбензотиазолин-(6)-сульфоновую кислоту, растворенную в количестве 1 ммоль в 0,05 М цитратном буфере pH 4,0. Через 15 мин по оптической плотности раствора в лунках при длине волны 450 нм определяли ферментативную активность, пропорциональную содержанию специфических антител. Результаты измерений оптической плотности в отдельных лунках приведены ниже. 1-19 - 0 104-107 - 0 20 - 0,2 108 - 0,3 21-25 - 0 109 - 0 26 - 0,92 110 - 0,6 27 - 0 111-146 - 0 28 - 0,15 147 - 0,3 29-41 - 0 147-157 - 0 42 - 0,2 158 - 0,5 43 - 0 159-164 - 0 44 - 0,2 165 - 0,3 45-60 - 0 166-169 - 0 61 - 0,6 170 - 0,15 62-102 - 0 171-172 - 0 103 - 0,3 173 - 0,3 174-176 - 0 242-263 - 0 177 - 0,2 264 - 1,2 178-180 - 0 265-267 - 0 181 - 0,4 268 - 1,6 182-186 - 0 269-275 - 00 187 - 0,6 276 - 0,5 188-190 - 0 277-280 -0 191 - 0,6 281 - 1,2 192-202 - 0 282-296 - 0 203 - 0,15 297 - 0,25 204-212 - 0 298-306 - 0 213 - 0,2 307 - 0,8 214-222 - 0 308-373 - 0 223 - 0,5 374 - 0,4 224-240 - 0 375-397 - 0 241 - 0,6 398 - 0,7
399-400 - 0
Таким образом, в результате анализа выявлены гибридомы, синтезирующие моноклональные антитела к пероксидазе (30 положительных клонов из 400 тестируемых).

П р и м е р 5. Определение мышиного иммуноглобулина G по методу двойных антител.

В лунки полистирольного микропланшета вносили раствор кроличьих антимышиных антител (10 мг/мл в карбонатном буфере pH = 9,5), полученных из сыворотки крови иммунного кролика осаждением полиэтиленгликолем и сульфатом аммония с последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Смесь инкубировали 20 ч при 4^оС, удаляли и микропланшеты 3-кратно промывали ФСБТ, с последующим внесением овальбумина как описано в примере 7. В лунки вносили известные концентрации иммуноглобулинов G мыши на два часа при температуре 37^оС в ФСБТ, содержащем 0,5% овальбумина и 0,1% фетальной сыворотки. По истечении указанного времени смесь удаляли, планшеты промывали ФСБТ и добавляли конъюгат лакказы с козьими антимышиными антителами (2 мкг/мл). После одночасовой инкубации планшеты промывали ФСБТ и вносили субстрат, как описано в примере 4.

П р и м е р 6. Определение антигена конкурентным методом с использованием антигена, сорбированного на твердой фазе, и меченных лакказой антител.

В качестве определяемого антигена использовали инсулин свиньи, сорбцию которого на микропланшете проводили как описано в примере 5. В лунки подготовленного микропланшета вносили 50 мкл известных концентраций инсулина свиньи и 50 мкл конъюгата лакказы с моноклональными антителами на инсулин. Инкубацию проводили 2 ч при температуре 37^оС, раствор удаляли и микропланшеты 3-кратно промывали ФСБТ. Субстрат вносили в лунку, как описано в примере 4, и через 1 ч измеряли оптическую плотность.

П р и м е р 7. Сравнительная характеристика иммунолакказного иммунопероксидазного конъюгатов.

Сорбцию антигена-иммуноглобулинов G мыши проводили как описано в примере 5. В лунки с сорбированными иммуноглобулинами и овальбумином вносили различные концентрации антимышиных иммуноконъюгатов лакказы и пероксидазы с ФСБТ с овальбумином и фетальной сывороткой, как описано в примере 5 и инкубировали 1 ч при температуре 37^оС. По истечении указанного времени раствор удаляли и плашки промывали 3-кратно ФСБТ, добавляли субстрат, как описано в примере 5 (в лунки, содержащие пероксидазный конъюгат, добавляли перекись водорода в концентрации 25 мМ). Абсолютную чувствительность конъюгатов измеряли через определенные промежутки времени.

П р и м е р 8. Определение моноклональных антител к инсулину с помощью иммунолакказного конъюгата (непрямой ИФА с активидовым конъюгатом).

200 мкл инсулина свиньи (10 мкг/мл в карбонатном буфере pH 9,5) вносили в лунки микропланшета для иммуноферментного анализа, дальнейшие операции выполняли как описано в примере 5, но вместо иммуноглобулинов G мыши использовали моноклональные антитела к инсулину, продуцируемые гибридомой, полученной слиянием клеток мышиной миеломы Sp 210 и иммунными спленоцитами мышей линии BALBC, и принадлежащую к подклассу Ig G_2a.
П р и м е р 9. Сравнение абсолютной чувствительности конъюгатов пероксидазы и лакказы ("сэндвич"-метод) с антителами.

Сорбцию кроличьих антимышиных антител проводили как описано в примере 5. В подготовленные плашки с антивидовыми антителами и овальбумином вносили известные концентрации иммуноглобулина G мыши в качестве антигена (пример 5). На рисунке 6 приведены зависимости концентрации определяемых антител и величина отклика при длине волны 450 нм при проявлении двумя типами иммуноферментных конъюгатов. Использование иммунолакказного конъюгата позволяет определять более низкие концентрации антител.

Как следует из приведенных примеров, по сравнению с прототипом использование заявляемого способа позволяет повысить точность определений на порядок.

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам проведения иммуноферментного анализа и веществам, используемым для этих целей. Цель изобретения - снижение трудоемкости получения конъюгата, повышение его стандартности, повышение точности и упрощение технологии иммуноферментного анализа. С этой целью в качестве конъюгата вводят препарат, содержащий компоненты лакказы из Coriolus hirsutus и реагена, способного взаимодействовать с веществом, иммобилизованным на твердой фазе, а в качестве второго субстрата используют кислород воздуха. 1 с. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Конъюгат для иммуноферментного анализа, полученный путем окисления фермента периодатом натрия и соединения его с биоспецифическим реагентом, с последующей очисткой конъюгата на хроматографической колонке, отличающийся тем, что в качестве фермента используют лакказу. 2. Способ иммуноферментного анализа, включающий обработку твердой фазы иммунологическим реагентом, отделение непрореагировавшей жидкой фазы, обработку твердой фазы ферментсодержащим конъюгатом, разделение жидкой и твердой фаз и анализ одной из них с помощью первого и второго субстрата, отличающийся тем, что обработку твердой фазы ведут иммунолаккозным конъюгатом, а в качестве второго субстрата используют кислород воздуха.