СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИОГЕНИНА В МОЛОЧНОМ СЫРЬЕ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/04 C07K14/515 

Изобретение относится к молочной, мясной, промышленности, ветеринарии, медицине, биологии, а именно к количественному определению белковых веществ.

Известен способ количественного определения белковых веществ иммуноферментным анализом (ИФА) на основе моноклональных антител. Так, известен метод количественного определения белковых веществ, в частности ангиогенина в сыворотке крови человека и мыши (Olson e.a.-Biochemistry, v.33.P.5421-5427.1994). Этот способ основан на получении моноклональных антител к специфическим эпитопам белка. Данный способ является чувствительным, но при этом достаточно сложным и продолжительным.

Также известен способ количественного определения белковых веществ ИФА на основе поликлональных антител. Способ заключается в максимально возможной очистке исследуемых образцов от белков, имеющих общие с ангиогенином эпитопы, с последующим ИФА конкурентным методом, сендвич-методом или радиоиммунным методом. Так, известен способ определения ангиогенин подобного белка в сыворотке крови мыши ИФА "ELISA", заключающийся в использовании конъюгатов с щелочной фосфатазой и использовании хроматографической очистки в два этапа: на СМ-52; Mono S колонке (Nobile V., Vellee B., Shapiro R. Characterization of mouse angiogenin-related protein: Implications for functional studies on angiogenin// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996.- V.93, P.4331-4335).

Данные методы ИФА разработаны для определения ангиогенина человека и мыши, а так называемый бычий ангиогенин (ангиогенин, содержащийся в коровьем молоке) имеет специфические особенности, затрудняющие его количественное определение.

Также известен способ ИФА на основе поликлональных антител ангиогенина бычьей крови, молока и ткани быка, заключающийся в ИФА сендвич-методом с использованием Western blot анализа (Chahg S.I., Jeong G-B. Park SH, Ahn B-C, Choi jD, Chae Q, Namgoong S-K Chung S-I. Detection. Quantitation, and Localization of Bovine Angiogenin by immunological Assays// Bioch.Bioph.Res. Commun. - 1997. - v. 232, 2, p.323 - 327). Данный способ взят в качестве прототипа. При достаточной чувствительности данного способа его недостатком является использование дорогостоящей аппаратуры для очистки, а также продолжительность и многоэтапность очистки.

Задачей изобретения является разработка чувствительного, дешевого и простого механизма проведения способа количественного определения ангиогенина в молочном сырье на основе ИФА.

Это достигается тем, что образец молочного сырья центрифугируют, отделяют контрольный образец с целью установления возможной перекрестной реакции и очищают его от ангиогенина с помощью афинной хроматографии, проводят ИФА конкурентным методом на основе поликлональных антител. При этом для количественного определения ангиогенина может использоваться молочное сырье, содержащее вещество, высоко гомологичное ангиогенину - панкреатическую РНКазу.

Согласно изобретению молочное сырье обезжиривают центрифугированием, так как молочный жир затрудняет проведение последующих процедур анализа. Далее ставят эксперимент с целью исключения возможности существования перекрестной реакции поликлональных антител (АТ) к ангиогенину с панкреатической РНКазой, содержащейся в молочном сырье и имеющей 40% гомологию по аминокислотному составу с ангиогенином. Установление отсутствия перекрестной реакции позволяет упростить методику проведения исследования без снижения чувствительности и достоверности способа количественного определения ангиогенина в молочном сырье. Для этого молочное сырье с помощью аффинной хроматографии, носителем в которой является синтезированный конъюгат поликлональных антител с BrCn-активированной сефарозой 4B, очищают от ангиогенина. Далее на полученном фильтрате готовят растворы стандартного препарата ангиогенина с различной концентрацией. Синтезируют конъюгат с пероксидазой хрена и проводят ИФА с поликлональными АТ к ангиогенину в приготовленных растворах и исследуемом образце. Проводят измерение оптической плотности в стандартных образцах с известной концентрацией ангиогенина (C) при A 405-410 нм. По этим результатам строят калибровочную кривую (функциональная зависимость А от Lg C). Одновременно проводят измерения оптической плотности в исследуемом образце и по калибровочной кривой определяют концентрацию ангиогенина в исследуемом образце.

Способ осуществляется следующим образом. Молочное сырье обезжиривают центрифугированием. Ставят контрольный опыт. Для этого исследуемое молочное сырье очищают от ангиогенина афинной хроматографией путем пропускания сырья через колонку, носителем в которой является синтезированный конъюгат поликлональных антител с BrCn-активированной сефарозой 4B. Подготавливают полистирольные планшеты с сорбированным в лунках ангиогенином известной концентрации. Синтезируют конъюгат поликлональных антител к ангиогенину с пероксидазой хрена и по 50 мкл добавляют в каждую лунку. Инкубируют при 36 - 38^oC в течение 1 ч. Промывают планшет буфером до pH 7,4. Вносят в каждую лунку субстрат и выдерживают до образования интенсивно зеленого цвета. После чего проводят измерение оптической плотности при A 405-410 нм. По калибровочной кривой (функциональная зависимость оптической плотности A от концентрации lgC) определяют десятичный логарифм концентрации ангиогенина с последующим пересчетом в весовую концентрацию.

Пример 1. 50 мкл обезжиренного центрифугированием коровьего молока вносили в лунки планшета с сорбированным ангиогенином известной концентрации. Синтезировали коньюгат поликлональных антител к ангиогенину с пероксидазой хрена и по 50 мкл вносили в каждую лунку планшета. Инкубировали при 36 - 38^oC в течение 1 часа Промывали планшет буфером до pH 7,4. Вносили в каждую лунку по 200 мкл субстрата и выдерживали до образования интенсивно зеленого цвета. Проводили измерение оптической плотности при A 405-410 нм. По калибровочной кривой определяли концентрацию ангиогенина. Определение концентрации ангиогенина в молоке проводили в 5-ти кратной повторности. Концентрация ангиогенина в молоке составила 1,2 мг/л.

Пример 2. Осуществляли по примеру 1, используя в качестве сырья подсырную сыворотку, полученную при производстве голландского сыра. При этом концентрация ангиогенина составила 0,8 мг/л.

Данный способ ИФА на основе поликлональных антител конкурентным методом имеет чувствительность 10 нг/мл, что соответствует общепринятой чувствительности ИФА при использовании меченных пероксидазой антител и позволяет с требуемой достоверность применять для молочного сырья.

Изобретение относится к молочной, мясной промышленности, ветеринарии, медицине, биологии, а именно к количественному определению белковых веществ. Образец молочного сырья обезжиривают центрифугированием. Отделяют контрольный образец. Очищают его от ангиогенина с помощью афинной хроматографии. Контроль и исследуемый образец подвергают иммуноферментному анализу конкурентным методом. Измеряют оптическую плотность и по калибровочной кривой определяют количество ангиогенина. Изобретение позволяет разработать чувствительный, дешевый и простой механизм определения количества антиогенина в молочном сырье на основе иммуноферментного анализа.

Способ количественного определения ангиогенина в молочном сырье путем проведения иммуноферментного анализа на основе поликлональных антител, отличающийся тем, что исследуемый образец центрифугируют, отделяют контрольный образец и очищают его от ангиогенина с помощью афинной хроматографии, затем контроль и исследуемый образец подвергают иммуноферментному анализу конкурентным методом, измеряют оптическую плотность при А 405-410 нм, определяют разницу оптической плотности и по калибровочной кривой определяют количество ангиогенина.