СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА С АКТИВНОСТЬЮ СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА Российский патент 1994 года по МПК C12N9/64 

Изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу получения препарата с активностью сычужного фермента, предназначаемого для использования в сыроделии.

Известен способ получения сычужного фермента из сычугов телят, основанный на экстракции фермента в кислой среде, отделении и высушивании порошка. Однако специфическая активность фермента является низкой и составляет около 470000 ЕД.

Наиболее близким к заявленному, принятым за прототип, является способ получения сычужного фермента, основанный на измельчении сычугов телят, набухании сырья в воде, экстракции при рН 2,4-3,5 анолитной водой, полученной в результате электролиза, при жидкостном коэффициенте 1:30, температуре 20-40^оС, силе тока 5-15А и напряжении 220 В, с последующей фильтрацией экстракта, высаливанием фермента путем добавления хлорида натрия из расчета 15% от массы экстракта, отделением фермента центрифугированием и сушкой в токе воздуха при температуре 30-35^оС.

Схематически технологический процесс получения сычужного фермента по известному способу представлен на фиг.1.

Недостатки известного способа заключаются в технической сложности процесса, связанной с монтажом и эксплуатацией установки для получения анолитной воды, в необходимости использования дорогостоящего сырья - сычугов телят, а также в получении фермента с относительно невысоким выходом и активностью (соответственно 48,5% и 750000 усл.ед.).

Целью изобретения является упрощение и повышение экономичности способа за счет расширения сырьевой базы, увеличение выхода и активности фермента.

Это достигается тем, что в способе получения препарата с активностью сычужного фермента, включающем измельчение сырья, экстракцию при рН 2,4-3,5 и температуре 20-40^оС, высаливание фермента хлоридом натрия, его отделение и сушку, в качестве сырья используют внутренности карповых рыб, перед экстракцией сырья осуществляют его обезжиривание ацетоном, а высаливание фермента хлоридом натрия проводят при концентрации соли 5-10% от массы экстракта. При этом экстракцию сырья проводят в две стадии при массовом соотношении сырья и воды 1:10-12 и времени экстракции 2-4 ч.

На фиг.2 изображена схема технологического процесса получения препарата с активностью сычужного фермента по предлагаемому способу.

Поиск в различных источниках информации показал, что использование внутренностей карповых рыб для увеличения выхода и специфической активности целевого продукта неизвестно, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии заявленного технического решения критерию изобретения "существенные отличия".

Наличие отличительных признаков заявленного технического решения по сравнению с прототипом подтверждает, что оно соответствует критерию изобретения "новизна".

Использованные в заявленном способе существенные признаки являются логически обоснованными.

Известно, что внутренности карповых рыб содержат высокие концентрации ферментов, в том числе ферментов, обладающих молокосвертывающей активностью. Проведенными исследованиями было подтверждено присутствие во внутренностях карповых рыб вещества, обладающего активностью сычужного фермента. При этом лучшие результаты были достигнуты при использовании в качестве источника сырья внутренностей чехони (Pelecus cultratus), обитающей в бассейнах Азовского и Черного морей.

Большие запасы этого сырья, не имеющего самостоятельного пищевого значения, делают его использование для получения целевого продукта более перспективным, чем дорогостоящие и дефицитные сычуги телят по известному способу, и позволяют получить высокий экономический эффект.

Поскольку внутренности карповых рыб содержат значительное количество липидов, ингибирующих процесс экстракции действующих веществ, было предложено перед экстракцией сырья проводить его обезжиривание путем общепринятого способа обработки ацетоном.

Что касается самого процесса экстракции, то целесообразно использовать в качестве экстрагента не аналитную воду, получение которой связано со значительными техническими трудностями, а обычную воду, подкисленную, как и в известном способе, до рН 2,4-3,5, поскольку именно в этом интервале рН создаются оптимальные условия для работы фермента.

Принимая во внимание то обстоятельство, что использовалось обезжиренное сырье, оказалось возможным уменьшить жидкостной коэффициент с 1: 30 (известный способ) до 1:10-12. Уменьшение весового соотношения сырья и воды (менее 1: 10) приводило к образованию системы густой консистенции, из которой фермент медленно экстрагировался, а увеличение этого соотношения (более 1:12) приводило к нецелесообразному разбавлению системы.

Продолжительность процесса экстракции 2-4 ч была выбрана потому, что при меньшем времени экстракции выход целевого продукта снижался, а при большем времени дополнительного увеличения его выхода не достигалось, а, наоборот, возникала опасность микробиального загрязнения среды.

Вместе с тем, для максимального извлечения фермента из сырья оказалось необходимым проведение повторной его экстракции. Дальнейшее увеличение числа экстракций не приводило к извлечению сколь-либо значительных количеств фермента.

Что касается высаливания фермента хлоридом натрия, то максимальное его количество переходит в осадок при концентрации соли в экстракте 5-10%. Уменьшение концентрации соли (менее 5%) приводит к снижению выхода целевого продукта, а увеличение ее концентрации способствует переходу в целевой продукт примесей, в силу чего его специфическая активность снижается.

Температурные параметры экстракции (20-40^оС) и сушки фермента (30-35^оС) были оставлены без изменений по сравнению с известным способом, поскольку они являются оптимальными для сохранения биологических свойств продукта.

П р и м е р 1. 1 кг внутренностей чехони (Pelecus cultratus) измельчают на мясорубке и обезжиривают дважды 2 объемами ацетона (по 2 л) при 0^оС в течение 2 ч, остаток сырья сушат 10 ч до удаления запаха ацетона и экстрагируют 10 л воды (ж.к. 1:10), подкисленной 1 н. HCl до рН 2,4, при 20^оС в течение 2 ч. Осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин) и снова экстрагируют в тех же условиях 10 л воды, рН 2,4. Осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин), экстракты соединяют, к 16 л объединенных экстрактов добавляют 800 г NaCl (5% от массы экстракта) и выдерживают 30 мин при 20^оС, образующийся осадок отделяют, сушат в потоке воздуха при 30^оС и получают 525 г порошка фермента (52,5% от массы сырья) с активностью 900000 усл.ед.) (активность препарата определяли по ОСТ 49-14479).

П р и м е р 2. 1 кг внутренностей сазана (Cyprinus carpio) измельчают на мясорубке и обезжиривают дважды 2 объемами ацетона (по 2 л) при 0^оС в течение 3 ч, остаток сырья сушат 10 ч и экстрагируют 11 л воды (ж.к. 1:11), подкисленной 1 н. HCl до рН 3,0, при 30^оС в течение 3 ч. Осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин) и снова экстрагируют в тех же условиях 11 л воды, рН 3,0. Осадок отделяют центрифугированием, к 18 л объединенных экстрактов добавляют 1,35 кг NaCl (7,5% к массе экстракта) и выдерживают 45 мин при 20^оС. Осадок отделяют, сушат в потоке воздуха при 32^оС и получают 535 г продукта (53,5% от исходной массы сырья) с активностью 925000 усл.ед.

П р и м е р 3. 1 кг внутренностей белого леща (Parabramis pekinensis) измельчают на мясорубке и обезжиривают дважды 2 объемами ацетона (по 2 л) при 0^оС в течение 4 ч, остаток сырья сушат 10 ч и экстрагируют 12 л воды (ж.к. 1:12), подкисленной 1 н. HCl до рН 3,5, при 40^оС в течение 4 ч. Осадок отделяют центрифугированием и снова экстрагируют в тех же условиях 12 л воды, рН 3,5. Осадок отделяют центрифугированием, к 20 л объединенных экстрактов добавляют 2 кг NaCl (10% к массе экстракта) и выдерживают 1 ч при 20^оС. Осадок отделяют, сушат в потоке воздуха при 35^оС и получают 550 г порошка фермента (55% от исходной массы сырья) с активностью 950000 усл.ед.

При изменении заявленной совокупности признаков положительный эффект не достигается, что подтверждается сравнительными примерами 4-11.

П р и м е р 4. 1 кг внутренностей чехони измельчают на мясорубке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что обезжиривание сырья не производят. При этом выход целевого продукта составляет 175 г (17,5% от массы сырья), а активность 750000 усл.ед.

П р и м е р 5. 1 кг внутренностей чехони измельчают на мясорубке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что экстракцию сырья на первой стадии проводят при жидкостном коэффициенте 1:9. При этом образуется густая масса, которая не разделяется при центрифугировании и потому осуществление дальнейших стадий технологического процесса не представляется возможным.

П р и м е р 6. 1 кг внутренностей чехони измельчают на мясорубке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что экстракцию сырья на каждой стадии осуществляют при ж.к. 1:13. При этом выход и активность целевого продукта остаются таким же, как в примере 1 (525 г и 900000 усл. ед.), что свидетельствует о нецелесообразности излишнего разбавления среды.

П р и м е р 7. 1 кг внутренностей чехони измельчают на мясорубке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что время экстракции на каждой стадии составляет 1 ч. При этом выход целевого продукта составляет 345 г (34,5% к массе исходного сырья).

П р и м е р 8. 1 кг внутренностей чехони измельчают на мясорубке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что время экстракции на каждой стадии составляет 5 ч. Выход и активность целевого продукта остаются такими же, как в примере 1 (525 г и 900000 усл.ед.), что свидетельствует о нецелесообразности удлинения процесса экстракции.

П р и м е р 9. 1 кг внутренностей чехони измельчают на мясорубке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что вторую экстракцию сырья не производят. При этом выход целевого продукта составляет 290 г (29% к исходной массе сырья).

П р и м е р 10. 1 кг внутренностей чехони измельчают на мясорубке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что концентрация NaCl составляет 3% от массы экстракта. Получают 118 г целевого продукта (выход 11,8% от массы сырья) с активностью 800000 усл.ед.

П р и м е р 11. 1 кг внутренностей чехони измельчают на мясорубке и далее поступают, как в примере 1, за исключением того, что концентрация NaCl составляет 12% от массы экстракта. Получают 585 г порошка (выход 58,5% ) с активностью 140000 усл.ед.

Сопоставительный анализ технико-экономических показателей заявляемого объекта и известного способа приведены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемый способ позволяет повысить выход (на 4-6,5%) и активность (в 1,25 раза) целевого продукта при использовании малоценного источника сырья - внутренностей карповых рыб.

Использование: относится к биотехнологии, конкретно к способу получения препарата с активностью сычужного фермента, предназначенного для использования в сыроделии. Сущность изобретения: способ предусматривает использование в качестве сырья внутренностей карповых рыб, перед экстракцией сырья осуществляют его обезжиривание ацетоном, а высаливание фермента хлоридом натрия проводят при концентрации соли 5 - 10% от массы экстракта. При этом экстракцию сырья проводят в две стадии при массовом соотношении сырья и воды 1 : 10 - 12 и времени экстракции 2 - 4 ч. 1 з.п.ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА С АКТИВНОСТЬЮ СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА, включающий измельчение сырья, экстракцию при рН 2,4 - 3,5 и температуре 20 - 40^oС, высаливание фермента хлоридом натрия, его отделение и сушку, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения экономичности способа за счет расширения сырьевой базы, увеличения выхода и активности фермента, в качестве сырья используют внутренности карповых рыб, перед экстракцией сырья осуществляют его обезжиривание ацетоном, а высаливание фермента хлоридом натрия проводят при концентрации соли 5 - 10% от массы экстракта. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию сырья проводят в две стадии при массовом соотношении сырья и воды 1 : 10 - 12 и времени экстракции 2 - 4 ч.