СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ТРИПТОФАНА Российский патент 1995 года по МПК C07K1/12 A61K38/01 

Изобретение относится к химической технологии и фармакологии, конкретно к способу получения пептидов с высоким содержанием триптофана, которые могут быть использованы для лечебных целей, в том числе для достижения снотворного эффекта.

Известно, что триптофан относится к числу незаменимых аминокислот и играет заметную роль в регуляции жизненно-важных функций организма.

Однако лишь ограниченное количество белков содержит эту аминокислоту, причем ее физиологические функции проявляются главным образом, если она находится в свободном состоянии или в составе относительно низкомолекулярных пептидов.

Известен способ получения пептидов, содержащих триптофан принятый за прототип, согласно которому белок лактальбумин суспендируют в воде, подвергают щелочному гидролизу при рН 8,5 в течение 10-12 ч, затем ферментативному гидролизу пепсином при 50^оС в течение 6 ч, после чего фермент инактивируют нагреванием при 90-100^оС в течение 15-20 мин, центрифугируют, надосадочную жидкость отделяют, осаждают ацетоном и осадок сушат (фиг.1).

Недостаток известного способа заключается в том, что молекула лактальбумина содержит незначительное количество триптофана около 5 молей/10⁵ г белка. Поэтому получаемый целевой продукт также имеет низкое содержание триптофана (около 4,5-5,0 г/100 г белка), а его снотворное действие проявляется в дозах, не ниже 0,05-0,1 г/кг массы тела при пероральном введении.

Изобретение решает задачу получения пептидов с высоким содержанием триптофана, снотворное действие которых проявляется в низких дозах.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения пептидов с высоким содержанием триптофана, включающем суспендирование белка в воде, щелочной и ферментативный гидролиз белка, инактивирование фермента при 90-100^оС в течение 15-20 мин, центрифугирование гидролизата, отделение надосадочной жидкости, осаждение ее ацетоном и сушку осадка, в качестве белка используют фибриноген, перед щелочным гидролизом проводят кислотный гидролиз, а в качестве фермента используют трипсин в количестве 30-36 ед/1 мг белка, при этом кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз осуществляют соответственно при рН 2-3, 9,5-10 и 7-7,5, и температурах 90-100, 80-90 и 37-40^оС в течение 10-12, 4-6 и 8-10 ч (фиг.2).

Предложенный способ имеет преимущества перед известным, в части того, что молекула фибриногена содержит в 3 раза больше триптофана (около 16 молей/10⁵ г белка), чем лактальбумин, а для расщепления этого белка кроме щелочного и ферментативного гидролиза используется еще и кислотный гидролиз, что создает условия для получения большего числа триптофан-содержащих пептидов. Получаемый целевой продукт содержит в 1,3-1,5 раза больше триптофана и оказывает снотворный эффект в опытах на лабораторных животных в 5 раз более низких дозах, чем препарат, получаемый по известному способу.

П р и м е р 1. 0,5 г фибриногена (использован препарат фибриногена, вырабатываемый отечественной промышленностью из плазмы крови доноров), суспендируют в 500 мл воды, суспензию подкисляют 6 н. раствором HCl до рН 2,0 и нагревают в запаянных ампулах при 90^оС в течение 10 ч, затем содержимое ампул подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 9,5, ампулы снова запаивают, нагревают при 80^оС в течение 4 ч, содержимое ампул нейтрализуют 6 н. HCL до рН 7,0, к 500 мл раствора добавляют 50 мг трипсина (использован препарат трипсина кристаллического, вырабатываемый отечественной промышленностью из поджелудочных желез убойных животных) (≈ 0,3 ед/мг белка), инкубируют при 37^оС в течение 8 ч, после чего фермент инактивируют нагреванием при 90^оС в течение 15 мин, гидролизат центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость отделяют, осаждают 3 объемами ацетона, осадок отделяют, промывают многократно ацетоном и сушат на воздухе. Получают 0,42 г белого порошка, представляющего собой смесь пептидов с общим содержанием триптофана 6 г/100 г белка. Введение этого порошка животным перорально в дозах 0,01-0,02 г/кг массы тела вызывает снотворный эффект через 30-40 мин.

П р и м е р 2. 0,5 г фибриногена суспендируют в 500 мл воды, суспензию подкисляют 6 н. раствором HCl до рН 2,5 и нагревают при 95^оС в течение 11 ч, затем подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 9,75, нагревают при 85^оС в течение 5 ч, нейтрализуют 6 н. HCl до рН 7,25, к 500 мл раствора добавляют 55 мг трипсина (≈ 0,33 ед/1 мг белка), инкубируют при 38,5^оС в течение 9 ч, фермент инактивируют нагреванием при 95^оС в течение 17 мин, гидролизат центрифугируют 30 мин, надосадочную жидкость отделяют, осаждают 3 объемами ацетона, осадок отделяют, промывают многократно ацетоном и сушат на воздухе. Получают 0,43 г белого порошка, представляющего собой смесь пептидов с общим содержанием триптофана 7 г/100 г белка. Введение этого порошка животным перорально в дозах 0,01-0,02 г/кг массы тела вызывает снотворный эффект через 30-40 мин.

П р и м е р 3. 0,5 г фибриногена суспендируют в 500 мл воды, суспензию подкисляют 6 н. HCl до рН 3,0 и нагревают при 100^оС 12 ч, затем подщелачивают 1% -ным NaOH до рН 10,0, нагревают при 90^оС 6 ч, нейтрализуют 6 н. HCl до рН 7,5, к 500 мл раствора добавляют 60 мг трипсина (0,36 ед/мг белка), инкубируют при 40^оС 10 ч, фермент инактивируют нагреванием при 100^оС 20 мин, гидролизат центрифугируют 30 мин, надосадочную жидкость осаждают 3 объемами ацетона, осадок отделяют, промывают многократно ацетоном и сушат на воздухе. Получают 0,44 г белого порошка с содержанием триптофана 8 г/100 г белка, введение которого животным перорально в дозах 0,01-0,02 г/кг массы тела вызывает снотворный эффект через 30-40 мин.

Сопоставительный анализ технико-экономических показателей известного способа и заявляемого объекта представлен в таблице.

Таким образом, целевой продукт, полученный по предложенному способу, содержит в 1,3-1,5 раза больше триптофана и оказывает более быстрое снотворное действие в 5 раз более низких дозах.

Использование: химико-фармацевтическая промышленность, фармакология. Сущность изобретения: фибриноген суспендируют в воде и подвергают последовательно кислотному, щелочному и ферментативному гидролизу соответственно при рН 2-3, 9,5-10 и 7-7,5, при температурах 90-100, 80-90 и 37-40°С в течение 10-12, 4-6 ч и 8-10 ч, причем в качестве фермента используют трипсин в количестве 0,30-0,36 ед/1 мг белка; фермент инактивируют нагреванием при 90-100°С в течение 15-20 мин, гидролизат центрифугируют, надосадочную жидкость осаждают ацетоном и осадок сушат. 2 ил. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ТРИПТОФАНА, включающий суспендирование белка в воде, последующий щелочной и ферментативный гидролиз белка, инактивирование фермента при 90 100^oС в течение 15 20 мин, центрифугирование гидролизата, осаждение конечного продукта из надосадочной жидкости ацетоном и сушку осадка, отличающийся тем, что в качестве белка используют фибриноген, перед щелочным гидролизом проводят кислотный гидролиз при pH 2 3, температуре 90 100^oС в течение 10 12 ч, щелочной гидролиз осуществляют при pH 9,5 10,0, температуре 80 90^oС в течение 4 6 ч, а ферментативный при pH 7,0 7,5, температуре 37 40^oС в течение 8 10 ч с использованием в качестве фермента трипсина из расчета 0,30 0,36 единиц на 1 мг белка.