СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА "ИНГИПРОЛ" Российский патент 2003 года по МПК A61K35/12 A61K35/42 A61K35/55 A61K35/78 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к технологии получения основного ингибитора протеиназ (ОИП) из органов крупного рогатого скота (КРС).

"Ингипрол" - препарат, обладающий способностью ингибировать действие протеиназ: трипсина, химотрипсина, калликреина и плазмина, что является основанием для его использования в профилактике и лечении целого ряда заболеваний, например, панкреатитов, послеоперационных осложнений, а также других заболеваний, сопровождающихся повышением активности протеолитических и фибринолитических ферментов.

Белковые ингибиторы протеиназ выделяют из различных источников растительного и животного происхождения.

Известен способ получения ОИП (панкреатического ингибитора типа Кунитца) из органов КРС (Вопросы медицинской химии, 1994, т.40, N 3, с.25-31), заключающийся в том, что из отходов производства инсулина путем ионообменной хроматографии, химической очистки, высаливания, гель-хроматографии и осаждения выделяют субстанцию ВРТ1 медицинского назначения, получившую название "Ингипрол". Молекулярнная масса ингибитора протеиназ типа Кунитца составляет 6500 Да. Панкреатический ингибитор типа Кунитца является действующим началом лекарственных препаратов, широко используемых в клинической практике, таких как гордокс, контрикал и апротинин.

Недостатком известного способа является недостаточная чистота целевого продукта.

Известен способ получения ингибитора протеиназ из околоушных слюнных желез КРС (АС СССР N 1823184, кл. А 61 К 35/37, 1996), заключающийся в следующем: свежезамороженные железы гомогенизируют, гомогенат заливают раствором уксусной кислоты при соотношении ткань-кислота 1:8-1:10 с добавлением хлористого цинка в количестве 1 г на 1 литр смеси при рН 3-3,5. Экстракцию проводят при температуре +4-8^oС в течение 36-60 часов, экстракт фильтруют, фильтрат обрабатывают ацетоном в соотношении 1:5 при температуре -5 - +5^oС и формируют осадок в течение 18-22 часов. Полученный осадок, содержащий целевой продукт, растворяют в дистиллированной воде, фильтруют через цеолитовый фильтр, а фильтрат лиофилизируют. Полученный ингибитор протеиназ представляет собой комплекс полипептидов с мол. массой 2000-10000 Да.

Недостатками известного способа являются сложность, многостадийность процесса и недостаточная чистота целевого продукта.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения ОИП из органов КРС (Патент РФ N 2067868, кл. А 61 К 38/55, 1996), заключающийся в следующем: легкие, поджелудочную железу или слюнные железы КРС измельчают, проводят экстракцию в растворе фосфорной или серной кислоты, отделяют жмых, экстракт подвергают тепловой обработке для удаления липидов и белков, ОИП хроматографируют на катионите, из элюата с ионита после обработки соляной кислотой до рН 1-3 удаляют балластные белки, супернатант обрабатывают трихлоруксусной кислотой до ее концентрации 2,5-7,0%, удаляют примесные белки, высаливают ОИП хлоридом натрия до его конечной концентрации 320 г/л, отделяют высокомолекулярные белки и пигменты хроматографией, а затем выделяют конечный продукт осаждением ацетоном и лиофильно высушивают. В результате получают ОИП с выходом 10 мг/кг сырья и с активностью 5000 КИЕ/мг.

Недостатками известного способа являются многостадийность, сложность, длительность процесса и недостаточная чистота целевого продукта.

Технической задачей изобретения является повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Исходное сырье, преимущественно легкие КРС, измельчают в мясорубке, гомогенизируют, экстрагируют водным раствором соляной кислоты при рН 3-3,5 в течение 6-12 часов при комнатной температуре. По окончании экстракции жмых отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют хитозан из расчета 12-18 г на кг исходного сырья, доводят рН раствора до 8,0, перемешивают и отстаивают в течение 2-4 часов для сорбции на хитозане отрицательно заряженных белков и углеводов. Осадок отделяют центрифугированием или на нутч-фильтре с использованием бельтинг ткани. Осветленный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 5 кДа. К концентрату прибавляют хлорид натрия до его конечной концентрации 300-320 г/л, перемешивают до полного растворения соли и отстаивают, осадок отделяют. Далее осадок ОИП растворяют в воде, прибавляют 50%-ный ТХУ до достижения ее концентрации в растворе 2%, смесь выдерживают в течение 4-6 часов, осадок балластных белков отделяют центрифугированием или фильтрованием. Супернатант подщелачивают до 6,2-7,2 и наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой, проводя сорбцию целевого продукта при рН 6,2-7,2, а десорбцию 0,6-1,0 М раствором хлорида натрия при том же рН. Элюат обрабатывают 1%-ным раствором фенола при рН 3, осадок отбрасывают, супернатант дважды осаждают ацетоном. Осадок, содержащий целевой продукт, растворяют в 0,9 М растворе NaCl (физраствор) до концентрации 0,9-1,1 мг/мл по ОИП и добавляют консервант нипагин до концентрации 1,1-1,3 мг/мл. Бесцветный раствор подвергают стерилизующей фильтрации и фасуют в ампулы по 2, 5 и 10 мл.

Получают готовую лекарственную форму препарата "Ингипрол" в виде апирогенного инъекционного раствора с активностью 7000-7200 КИЕ/мг и выходом до 24 мг/кг сырья.

По данным электрофореза в полиакриламидном геле и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) препарат имеет гомогенный белковый состав и не содержит примесных белков.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются
1. Экстракт после отделения жмыха обрабатывают хитозаном из расчета 12-18 г на кг сырья при рН 8,0, что позволяет очистить целевой продукт в 10-20 раз путем сорбирования на положительно заряженном хитозане отрицательно заряженных примесных белков и углеводов.

2. Осветленный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах с лимитом пропускания 5 кДа, что позволяет сконцентрировать экстракт в 15-20 раз и избавиться от низкомолекулярных примесей.

3. После хроматографической очистки целевого продукта полученный элюат обрабатывают 1%-ным раствором фенола, что позволяет удалить липополисахаридные фрагменты, ответственные за пирогенность "Ингипрола".

4. Из супернатанта "Ингипрол" дважды осаждают ацетоном с последующим растворением осадка, содержащего целевой продукт, в физрастворе до концентрации 0,9-1,1 мг/мл, что позволяет дополнительно очистить продукт от примесных белков и получить стабильный инъекционный раствор с оптимальной концентрацией 0,9-1,1 мг/мл.

Кроме вышеперечисленных существенных признаков все стадии процесса оптимизированы и имеют следующий преимущественный вариант выполнения по сравнению с известным способом:
- экстракцию проводят раствором соляной кислоты при рН 3-3,5 в течение 6-12 часов, что позволяет упростить способ и повысить выход целевого продукта;
- для удаления балластных белков используют ТХУ до концентрации ее в растворе 2,0%, что позволяет повысить экологичность способа;
- сорбцию целевого продукта на карбоксиметилцеллюлозе осуществляют при рН 6,2-7,2, десорбцию 0,6-1 М раствором хлорида натрия при том же рН, что позволяет повысить чистоту продукта за счет удаления балластных белков;
- осаждение целевого продукта ацетоном проводят дважды при соотношении надосадочная жидкость:ацетон 1:2-3 при комнатной температуре, что позволяет повысить экологичность способа и обеспечить более полное отделение примесных компонентов;
- готовят раствор "Ингипрола" с оптимальной концентрацией 0,9-1,1 мг/мл с добавлением в качестве консерванта нипагина до концентрации 1,1-1,3 мг/мл, что позволяет получить стабильный при хранении препарат, пригодный для медицинского применения.

Таким образом, предлагаемый способ является патентоспособным, так как явным образом не следует из известного уровня техники, все стадии способа оптимизированы и являются результатом творчества, направленного на решение поставленной технической задачи. Сопоставительный анализ прототипа и заявляемого способа показал, что последний отличается от известного способа
- совокупностью действий (стадий процесса);
- последовательностью стадий;
- условиями и режимом проведения стадий способа.

Поиск по патентным и научно-техническим источникам не выявил известного способа, совпадающего с совокупностью существенных признаков заявляемого способа, в связи с чем можно сделать вывод, что предлагаемое техническое решение отвечает критериям изобретения "новизна и изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

50 кг замороженных легких КРС измельчают в мясорубке, гомогенизируют, добавляют 150 л воды и соляной кислоты до рН 3 и проводят экстракцию в течение 6 часов при комнатной температуре. По окончании экстракции жмых отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют 900 г хитозана, доводят рН раствора до 8,0 с помощью 5 М раствора NAOH, перемешивают и отстаивают в течение 2 часов. Осадок отделяют центрифугированием. Осветленный экстракт (150 л) концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 5 кДа. К 10 л полученного концентрата прибавляют хлорид натрия до его конечной концентрации 300 г/л и перемешивают до полного растворения соли. Через 4 часа осадок отделяют. Далее осадок ОИП растворяют в 1 л воды, прибавляют 50%-ный ТХУ до достижения ее концентрации 2%, смесь выдерживают в течение 4-х часов, осадок балластных белков отделяют центрифугированием. Подщелачивают супернатант до 6,2 с помощью 5М NAOH и наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой проводя сорбцию целевого продукта при рН 6,2, а десорбцию 0,6М раствором хлорида натрия при том же рН. Полученную фракцию элюата обрабатывают 1%-ным раствором фенола при рН 3, осадок отбрасывают, к супернатанту добавляют 2 объема ацетона, перемешивают и формируют осадок в течение 6 часов. Осадок растворяют и переосаждают ацетоном. Полученный осадок промывают в ацетоне и высушивают. Выход продукта составил 1200 мг. Целевой продукт растворяют в физрастворе до концентрации 0,9 мг/мл по ОИП, добавляют косервант нипагин до концентрации 1,1 мг/мл. Бесцветный раствор подвергают стерилизующей фильтрации и фасуют в ампулы по 2, 5 и 10 мл.

Получают апирогенный инъекционный раствор "Ингипрола" с активностью 7000 КИЕ/мг.

Пример 2.

Один кг замороженных околоушных желез КРС измельчают на мясорубке, гомогенизируют, добавляют 2,5 л воды и соляной кислоты до рН 3,5 и проводят экстракцию в течение 12 часов при комнатной температуре. По окончании экстракции жмых отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют 12 г хитозана, доводят рН раствора до 8,0, перемешивают и отстаивают в течение 4-х часов. Осадок отделяют на нутч-фильтре с использованием бельтинг ткани. Осветленный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 5 кДа. К концентрату прибавляют хлорид натрия до его конечной концентрации 320 г/л и перемешивают до полного растворения соли. Через 6 часов осадок отделяют. Далее осадок ОИП растворяют в 50 мл воды, прибавляют 50%-ный ТХУ до достижения ее концентрации 2,0%, смесь выдерживают в течение 6 часов, осадок балластных белков отделяют центрифугированием или фильтрованием. Доводят рН супернатанта до 7,2 с помощью 5М NAOH и наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой, проводя сорбцию целевого продукта при рН 7,2, а десорбцию 1,0 М раствором хлорида натрия при том же рН. Полученную фракцию обрабатывают 1%-ным раствором фенола при рН 3, осадок отбрасывают, к супернатанту добавляют 3 объема ацетона, перемешивают, формируют осадок в течение 8 часов. Полученный осадок растворяют в воде, переосаждают в ацетоне и высушивают. Выход продукта составил 5 мг. Целевой продукт растворяют в физрастворе до концентрации 1,1 мг/мл по ОИП, добавляют консервант нипагин до концентрации 1,3 мг/мл. Бесцветный раствор подвергают стерилизующей фильтрации и фасуют в ампулы по 2, 5 и 10 мл.

Получают апирогенный инъекционный раствор "Ингипрола" с активностью 7200 КИЕ/мг.

Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с известным, упростить способ, повысить его экологичность и повысить выход и чистоту целевого продукта.

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к способу получения ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота. Способ включает измельчение и гомогенизацию исходного сырья, экстракцию в кислой среде, отделение жмыха и последующую очистку целевого продукта высаливанием из экстракта с помощью хлорида натрия, осаждением примесных белков трихлоруксусной кислотой, катионо-обменной хроматографией, осаждением ацетоном и стерилизующей фильтрацией раствора, при этом к экстракту после отделения жмыха добавляют хитозан, осветленный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах с лимитом пропускания 5 кДа, элюат, полученный после хроматографической очистки на карбоксиметилцеллюлозе, обрабатывают 1%-ным раствором фенола, осадок удаляют, а из супернатанта дважды осаждают целевой продукт ацетоном с последующим растворением осадка в 0,9 М растворе хлорида натрия до концентрации 0,9-1,1 мг/мл. Технический результат - повышение выхода и чистоты целевого продукта. 4 з.п.ф-лы.

1. Способ получения препарата ''Ингипрол" из органов крупного рогатого скота, включающий измельчение и гомогенизацию исходного сырья, экстракцию в кислой среде, отделение жмыха и последующую очистку целевого продукта высаливанием из экстракта с помощью хлорида натрия, осаждением примесных белков трихлоруксусной кислотой, катионообменной хроматографией, осаждением ацетоном и стерилизующей фильтрацией раствора, отличающийся тем, что к экстракту после отделения жмыха добавляют хитозан в количестве 12-18 г на кг сырья при рН 8,0, выпавшие белки отделяют, осветленный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах с лимитом пропускания 5 кДа, элюат, полученный после хроматографической очистки на карбоксиметилцеллюлозе, обрабатывают 1%-ным раствором фенола, осадок удаляют, а из супернатанта дважды осаждают целевой продукт ацетоном с последующим растворением осадка в 0,9 М растворе хлорида натрия до концентрации 0,9-1,1 мг/мл. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию проводят в растворе соляной кислоты при рН 3-3,5 в течение 6-12 ч. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сорбцию целевого продукта на карбоксиметилцеллюлозе осуществляют при рН 6,2-7,2, а десорбцию 0,6-1,0 М раствором хлорида натрия при том же рН. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение ацетоном проводят при соотношении надосадочная жидкость : ацетон 1 : 2 - 3 при комнатной температуре. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к раствору целевого продукта добавляют нипагин до его концентрации 1,1-1,3 мг/мл.