СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА XIII СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/10 

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к способу получения фактора XIII свертывания крови - единст- венного профермента, катализирующего синтез ковалентных связей, соединяющих между собой мономерные единицы молекулы фибрина, и тем самым завершающего процесс свертывания крови и может быть использовано на предприятиях, вырабатывающих препараты из животного сырья.

Согласно современной ферментативной теории гемокоагуляция осуществляется в две стадии: образование тромбина из протромбина и образование фибрина из фибриногена под действием тромбина. При этом стабильный полимерный волокнистый сгусток фибрина образуется лишь при участии фактора XIII, являющегося ε - лизил - γ - глутамин - аминоацилтрансеразой или, согласно международной номенклатуре, фибринолигазой. Активность фактора XIII проявляется как in vitro, так и in vivo, что позволяет использовать его в медицинской практике в качестве компонента различных кровоостанавливающих препаратов, а также в биологических исследованиях для более глубокого понимания механизмов свертывания крови.

Известен способ получения фактора XIII из тромбоцитов человека или быка, основанный на фракционировании их минеральными солями и очистке фактора XIII осаждением полиэтиленгликолем и хроматографией на ионообменных смолах.

Недостатком известного способа является низкий выход целевого продукта (0,0008% к массе сырья).

Наиболее близким к заявленному является способ получения фактора XIII свертывания крови, основанный на использовании в качестве сырья плаценты млекопитающих, которую подвергают экстракции водой, с последующим высаливанием экстракта сернокислым аммонием, растворением осадка в воде, нагреванием раствора при 56^оС, отделением насадочной жидкости и очисткой содержащегося в ней целевого продукта хроматографией на ионообменных смолах и гель-фильтрацией.

Схема технологического процесса получения фактора XIII по известному способу может быть представлена в следующем виде (см.схему 1).

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения фактора XIII свертывания крови, включающем экстракцию животного сырья водой, отделение экстракта, его высаливание, очистку осадка и сушку, в качестве животного сырья используют семенники крупного рогатого скота (к.р.с.), в экстракт вводят 50-100 ЕД/л тромбина и выдерживают 2-4 ч при 37-40^оС и рН 5-7, высаливание проводят хлоридом натрия в количестве 50-70 г/л экстракта, а очистку осадка осуществляют последовательной обработкой при 0-6^оС 3-4 объемами сначала ацетона, затем этилового спирта и затем раствором соляной кислоты при 4-6^о и рН 4/5-4/7.

Схематически технологический процесс получения фактора ХIII по предложенному способу может быть представлен в следующем виде (см.схему 2).

Выход фактора XIII свертывания крови составляет 0,012-0,018% к массе исходного сырья, а его активность - 1850-1930 ЕД/мг.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявленное техническое решение отличается от известного использования иного животного сырья - семенников к.р.с. и иными приемами его обработки, в результате чего достигается повышение выхода и активности фактора XIII свертывания крови.

Совокупность существенных признаков, заявленных в изобретении, в известных технических решениях обнаружена не была.

Используемые в заявленном способе стадии технологического процесса являются логическими обоснованными.

Выбор в качестве животного сырья для получения фактора XIII семенников к. р. с. объясняется тем, что, согласно литературным данным, в этом органе содержится более высокая концентрация целевого продукта (150-270 мг/кг), чем в плазме крови (15-20 мг/л), тромбоцитах (20-30 мг/л), плаценте (25-55 мг/кг), печени (45-75 мг/кг) и др. тканях.

Сохранив, как и в известном способе, стадию экстракции сырья водой, поскольку именно вода извлекает максимальное количество фактора XIII из тканей, было предложено проводить активацию целевого продукта тромбином, поскольку осуществление процесса без этой стадии приводит к получению значительно менее активного фактора XIII.

Тромбин, являющийся сериновой протезой (КВ 3.4.4, 13), специфически активирует фактор XIII и является в этом отношении более эффективным по сравнению с трипсином, папаином или другими ферментами. Добавление к водному экстракту 50-100 Ед/л тромбина приводит к максимальной активации фактора XIII в течение 2-4 ч. При концентрации тромбина менее 50 ЕД/л такой активации не наблюдается, а при концентрации тромбина более 100 ЕД/л дальнейшего увеличения активности фактора XIII не отмечается.

Оптимальными условиями работы тромбина являлись температура 37-40^оС и рН 5,0-7,0, что подтверждается и литературными данными.

Что касается высаливания фактора XIII из водного экстракта, то использование с этой целью больших количеств сернокислого аммония (370-480 г/л), как это описано в известном способе, представляется нецелесообразным, поскольку при этом в осадок переходят практически все белковые вещества, содержащиеся в экстракте, что затрудняет выделение целевого продукта. Кроме того, удаление сернокислого аммония из осадка связано со значительными техническими трудностями. Поэтому для высаливания было предложено использовать хлорид натрия, причем в значительно меньших концентрациях (50-70 г/л). Именно в этом диапазоне концентраций происходит преимущественное осаждение целевого продукта, в то время как большинство других белковых примесей, отличающихся от фактора XIII по молекулярной массе, остается в насадочной жидкости.

В известном способе получения фактора XIII для его очистки предусмотрена термическая осадка после растворения в воде (при 56^оС), хроматография на диэтиламиноэтилцеллюлозе и фильтрация через гель сефадекса. Такая очистка является технически сложной и не гарантирует сохранения определенной части самого фактора XIII, что приводит к снижению его выхода и активности.

В предлагаемом способе предусматривается более простая и эффективная система очистки фактора XIII, основанная на последовательном осаждении его сначала ацетоном, а затем этиловым спиртом. При этом оптимальными параметрами процессов осаждения являются объемные соотношения осаждаемого раствора и растворителей 1 : 3-4 и температура 0-6^оС. Полное формирование в таком случае достигается за 4-6 ч.

Заключительным этапом очистки фактора XIII является осаждение его при рН 4,5-4,7. При этом формирование осадка наиболее полно происходит при 4-6^оС.

В результате реализации описанных стадий технологического процесса выход фактора XIII составляет 0,012-0,018% к исходной массе сырья (в 3-4,5 раза выше, чем в известном способе), а его активность достигает 1850-1930 ЕД/мг (в 1,54-1,6 раза выше, чем в известном способе).

П р и м е р 1. 1 кг Семенников к.р.с. измельчают на мясорубке, заливают 2 л воды и экстрагируют при постоянном перемешивании 1 ч, затем центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин, к 1700 мл надосадочной жидкости добавляют 85 ЕД тромбина (из расчета 50 ЕД на 1 л), устанавливают рН 5,0 добавлением 0,1 н. раствора HCl и выдерживают при 37^оС и периодическом перемешивании 2 ч, после чего добавляют 85 г NaCl (из расчета 50 г/л), через 1 ч осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин, растворяют в 100 мл воды, добавляют 300 мл ацетона (3 объема), охлаждают до 0^оС и оставляют на 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, добавляют 300 мл этилового спирта (3 объема), охлаждают до 0^оС и оставляют на 4 ч, осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, раствор охлаждают до 4^оС и осторожно подкисляют 0,1 HCl до рН 4,5, осадок отделяют, сушат и получают 120 мг (выход 0,012% к исходной массе сырья) фактора XIII свертывания крови с удельной активностью 1850 ЕД/мг.

П р и м е р 2. 1 кг Семенников к.р.с. измельчают на мясорубке, заливают 2,5 л воды и экстрагируют при постоянном перемешивании 1,5 ч, затем центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин, к 2100 мл надосадочной жидкости добавляют 157,5 ед тромбина (из расчета 75 ЕД/л), устанавливают рН 5,0 добавлением 0,1 н. раствора HCl и выдерживают при 38,5^оС и периодическом перемешивании 3 ч, после чего добавляют 126 г NaCl (из расчета 60 (г/л), через 1 ч осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, добавляют 350 мл ацетона (3,5 объема), охлаждают до 3^оС и оставляют на 5 ч, осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, добавляют 350 мл этилового спирта (3,5 объема), охлаждают до 3^оС, оставляют на 5 ч, осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, раствор охлаждают до 5^оС и осторожно подкисляют 0,1 н. HCl до рН 4,6, осадок отделяют, сушат и получают 150 мг (выход 0,015 % к исходной массе сырья) фактора XIII свертывания крови с активностью 1890 ЕД/мл.

П р и м е р 3. 1 кг Семенников к.р.с. измельчают на мясорубке, заливают 3 л воды и экстрагируют при постоянном перемешивании 2 ч, затем центрифугируют, к 2,5 л надосадочной жидкости добавляют 250 ЕД тромбина (из расчета 100 ЕД/л), устанавливают рН 7,0 и выдерживают при 40^оС и периодическом перемешивании 4 ч, после чего добавляют 175 г NaCl (из расчета 70 г/л), через 1 ч осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, добавляют 400 мл ацетона (4 объема), охлаждают до 6^оС и оставляют на 6 ч, осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, добавляют 400 мл этилового спирта (4 объема), охлаждают до 6^оС, оставляют на 6 ч, осадок отделяют, растворяют в 100 мл воды, раствор охлаждают до 6^оС и осторожно подкисляют 0,1 н. HCl до рН 4,7, осадок отделяют, сушат и получают 180 мг/ выход 0,018 % к исходной массе сырья) фактора XIII свертывания крови с активностью 1930 ЕД/мг.

При изменении заявленной совокупности признаков положительный эффект не достигается, что подтверждается сравнительными примерами 4-16.

П р и м е р 4 (сравнительный). 1 кг Плаценты коров измельчают на мясорубке, заливают 2 л воды и далее поступают как в примере 1. Получают 19 мг (выход 0,0019 % к исходной массе сырья) фактора XIII свертывания крови с активностью 1100 ЕД/мг.

П р и м е р 5 (сравнительный). 1 кг Семенников к.р.с. измельчают на мясорубке, заливают 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что после отделения экстракта к нему добавляют 85 г NaCl (из расчета 50 г/л), минуя стадию активации тромбином. Получают 110 мг фактора XIII свертывания крови (выход 0,011 % к исходной массе сырья) с активностью 1200 ЕД/мг.

П р и м е р 6 (сравнительный). 1 кг Семенников к.р.с. измельчают на мясорубке, заливают 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что к 1700 мл надосадочной жидкости после водной экстракции сырья добавляют 85 ЕД препарата трипсина. Получают 115 мг фактора XIII свертывания крови (выход 0,0115% к массе исходного сырья) с активностью 1450 ЕД/мг.

П р и м е р 7 (сравнительный). 1 кг Семенников к.р.с. измельчают на мясорубке, добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что активацию тромбином проводят при добавлении фермента из расчета 40 ЕД/л экстракта. Получают 120 мг фактора XIII (выход 0,0012% к массе исходного сырья) с активностью 1350 ЕД/мг.

П р и м е р 8 (сравнительный). К 1 кг измельченных семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что активацию тромбином проводят при добавлении фермента из расчета 110 ЕД/л экстракта. Получают 120 мг фактора XIII с активностью 1850 ЕД/мг, что свидетельствуют о нецелесообразности увеличения концентрации тромбина при активации.

П р и м е р 9 (сравнительный). К 1 кг измельченных семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что активацию тромбином проводят при рН 4,5 и 30^оС в течение 1,5 ч. Получают 115 мг фактора XIII с активностью 1250 ЕД/мг.

П р и м е р 10 (сравнительный). К 1 кг семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 2, за исключением того, что активацию тромбином проводят при рН 8,0 и 45^оС в течение 4,5 ч. Получают 120 мг фактора XIII (выход 0,012% к массе исходного сырья) с активностью 1250 ЕД/мг.

П р и м е р 11 (сравнительный). К 1 кг измельченных семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что высаливание проводят при концентрации NaCl 40 г/л. При этом осадок не образуется и дальнейшие стадии технологического процесса не могут быть осуществлены.

П р и м е р 12 (сравнительный). К 1 кг измельченных семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что высаливание проводят при концентрации NaCl 80 г/л. Получают 125 мг фактора XIII с активностью 1100 ЕД/мг.

П р и м е р 13 (сравнительный). К 1 кг измельченных семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что осаждение ацетоном проводят при использовании 2 объемов этого растворителя и при температуре 8^оС. При этом осадок не образуется и выделение фактора XIII оказывается невозможным.

П р и м е р 14 (сравнительный). К 1 кг измельченных семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что осаждение этиловым спиртом проводят при использовании 2 объемом этого растворителя и при температуре 8^оС. При этом осадок не образуется и выделение фактора XIII становится невозможным.

П р и м е р 15 (сравнительный). К 1 кг измельченных семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что после осаждения спиртом и растворения осадка в воде раствор охлаждают до 8^оС и подкисляют до рН 4,3. При этом появляется незначительная опалесценция, но осадок не формируется и выделить фактор XIII не представляется возможным.

П р и м е р 16 (сравнительный). К 1 кг измельченных семенников к.р.с. добавляют 2 л воды и далее поступают как в примере 1, за исключением того, что после осаждения этиловым спиртом и растворения осадка в воде раствор охлаждают до 2^оС и подкисляют до рН 4,9. При этом осадок не формируется и выделить фактор XIII не представляется возможным.

Фактор XIII свертывания крови, получаемый по предлагаемому способу, имеет выход и активность соответственно в 3-4,5 раза и 1,5-1,6 раза выше, чем по известному способу. Фактор XIII может храниться при -10^оС не менее 6 мес. без потери активности, полностью растворим в воде и гомогенен при исследовании методом ионообменной хроматографии, в то время как препарат, получаемый по известному способу, хранится лишь в течение 3 недель и содержит примеси, обладающие меньшей растворимостью в воде.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к способу получения фактора XIII свертывания крови - единственного профермента, катализирующего синтез ковалентных связей, соединяющих между собой мономерные единицы молекулы фибрина и тем самым завершающего процесс свертывания крови. Изобретение позволяет повысить выход и активность фактора XIII свертывания крови за счет того, что в качестве животного сырья используют семенники крупного рогатого скота, в экстракт вводят 50 - 100 ЕД/л тромбина и выдерживают 2-4 ч при 37-40°С и pH 5-7, высаливание проводят хлоридом натрия в количестве 50-70 г/л экстракта, очистку осадка осуществляют последовательной обртаботкой при 0-6°С 3-4 объемами сначала ацетона, затем этилового спирта и раствором соляной кислоты при 4-6°С и pH 4,5-4,7.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА XIII СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ, включающий экстракцию животного сырья водой, отделение экстракта, его высаливание, очистку осадка и сушку, отличающийся тем, что , с целью повышения выхода и активности, в качестве животного сырья используют семенники крупного рогатого скота, в экстракт вводят 50 - 100 ЕД/л тромбина и выдерживают 2 - 4 ч при 37 - 40^oС и pH 5 - 7, высаливание проводят хлоридом натрия в количестве 50 - 70 г/л экстракта, а очистку осадка осуществляют последовательной обработкой при 0 - 6^oС 3 - 4 объемами сначала ацетона, затем этилового спирта и затем раствором соляной кислоты при 4 - 6^oС и pH 4,5 - 4,7.