СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СТВОЛОВОЙ КРОВЕТВОРНОЙ КЛЕТКИ ОБЛУЧЕННЫХ ЖИВОТНЫХ (ЕГО ВАРИАНТЫ) Российский патент 1994 года по МПК A61K35/28 A61K31/66 

Изобретение относится к медицине и касается сохранения жизни животных после облучения путем восстановления полипотентной стволовой кроветворной клетки (ПСКК).

Известен способ сохранения жизни после облучения путем введения криоконсервированных до облучения клеток костного мозга и лимфоцитов. Способ обеспечивает выживание 76-93% мышей гибридов при костномозговом и 68-81% мышей линии С57В1/6 при кишечном синдроме.

Однако криоконсервирование клеток и тканей является очень дорогостоящим методом.

Известен способ сохранения жизни облученного организма, основанный на защите ПСКК от радиации путем введения животным до облучения радиопротекторов. Наиболее активны радиопротекторы, содержащие S и NH₂-группы, например, цистеамин, цистамин, глютатион. Но радиопротекторы не восстанавливают ПСКК после летального облучения животного.

Наиболее близким к заявляемому является способ восстановления стволовой кроветворной клетки, предусматривающий использование веществ, активирующих процессы репарации ДНК и/или дифференцировки клеток иммунной системы. Так, например, антитромбоцитарная сыворотка и интерферон восстанавливают клетки костного мозга (ККМ) после облучения животных сублетальными дозами. Яд среднеазиатских змей и/или тироксин при введении через сутки после облучения в дозах 6 и 8 Гр увеличивают выживаемость животных на 23-28%.

Видно, что ни один из этих способов не является достаточно эффективным в восстановлении ПСКК и сохранении жизни после летального облучения организма животного.

Целью изобретения является разработка способа, повышающего эффективность восстановления ПСКК и обеспечивающего сохранение жизни организма после летального облучения.

Поставленная цель достигается предлагаемым вариантами нового способа восстановления стволовой кроветворной клетки облученных животных.

По первому варианту извлеченные из облученного организма клетки костного мозга после отмывки в среде Игла инкубируют при концентрации (3-5)˙10⁶ клеток/мл при температуре 29-31^оС в течение 1-1,5 ч в среде, имеющей рН 6,0 и содержащей, мМ: трис.ацетат 30; хлористый натрий 150; ацетат магния 10; гидрофторид калия 5; теофиллин (в составе 2,4%-го эуфиллина) 5; 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту 5; глютатион окисленный 0,05; аденозинтрифосфорную кислоту (АТР) 0,05; фосфорнокислый натрий (однозамещенный) 0,1 и глюкозу 5,6, затем клетки костного мозга охлаждают до температуры 4-10^оС и вводят облученным животным внутривенно (в/в) в количестве не менее 10˙10⁶ живых клеток.

По второму варианту облученным животным в день облучения и через сутки вводят внутривенно в дозе 0,5 мл смесь, имеющую рН 6,0 и содержащую, мМ: трис. ацетат 30; хлористый натрий 150; ацетат магния 10; гидрофторид калия 5; теофиллин (в составе 2,4%-го эуфиллина) 5; 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту 3; глютатион окисленный 0,5; АТР 0,25 и глюкозу 556.

По третьему варианту облученным животным вводят внутрибрюшинно (в/б) в дозе 0,25 мл непосредственно после облучения аденозин-3'5'-монофосфат (сАМР) концентрации 0,1 мМ на 1 кг веса животного, по истечении 2-3 ч и на следующий день после облучения - следующую смесь, содержащую, мМ/кг: 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту 0,1; глютатион окисленный 0,1; АТР 0,1; теофиллин 8,8 и этилендиамин 6,6, а на четвертые сутки после облучения - смесь, содержащую, мМ/кг: cАМР 0,005, глютатион окисленный 0,005; 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту 0,01; АТР 0,1; теофиллин 4,4 и этилендиамин 3,3, причем все вводимые вещества растворяют в среде Игла, добавляя 1-3% раствор гидроокиси натрия до рН 7,0-7,4, а теофиллин и этилендиамин используют в составе 2,4%-го эуфиллина.

Объединение трех технических решений связано с тем, что три данных способа решают одну и ту же задачу - сохранение жизни животных после облучения летальной дозой - принципиально одним и тем же путем, а именно введением в инкубационную среду или облученному организму четырех основных веществ: 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновой кислоты, окисленного глютатиона, АТР и эуфиллина.

Предлагаемый способ существенно отличается от известных в медицинской практике и опубликованных в литературных источниках методов защиты организма от радиации и методов сохранения жизни организма после облучения. Существенным отличием способа является то, что вещества и их дозы вводятся животным направленно с учетом создания условий восстановления системы репарации ДНК путем поднятия общей транскрипционной, а отсюда функциональной активности ПСКК. Указанные особенности способа определяют его новизну и существенные отличия.

Сущность предлагаемого способа основана на том, что функциональная активность стволовой кроветворной клетки находится под контролем сАМР-зависимой регуляторной системы, и облучение вызывает резкое снижение ее активности. Введение в инкубационную среду (1 вариант) и животным (2 и 3 варианты) таких веществ, как окисленный глютатион, эуфиллин, АТР, индуцирует сАМР-зависимые фосфортрансферазные реакции. Вводимая одновременно с этими веществами 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота является Са⁺⁺-связывающим агентом, а потому она эффективная в ингибировании фосфодиэстераз сАМР и ДНКаз, активных в присутствии Са⁺⁺ и резко увеличивающих свою активность в облученных клетках. Сочетание указанных веществ с расширенным спектром действия и создает, очевидно, условия для более эффективной репарации при введении их после облучения.

Все вводимые животным или в инкубационную среду вещества известны, за исключением 2-S-тиурониоэтилиден-1,1- дифосфоновой кислоты. Это новое химическое вещество, впервые синтезировано в ИХКиГ СО АН СССР, зарегистрировано под N 4080381, в литературе не описано. Способ получения этой кислоты основан на реакции нуклеофильного присоединения тиомочевины к винилидендифосфоновой кислоте. Реакция протекает в водном растворе, кислой среде (рН ≈ 1) и дает целевое тиурониевое производное с выходом, близким к 100%. 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота может быть легко выделена из реакционной смеси в форме малорастворимого осадка.

Получение 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновой кислоты формулы

Смесь 2 г гидрата винилидендифосфоновой кислоты, содержащей 1,88 г (10 ммоль) безводного вещества, 3,0 г (40 ммоль) тиомочевины и 4 мл воды, нагревают 1 ч при кипении, разбавляют этанолом, отфильтровывают выпавшие кристаллы и промывают этанолом. Выход целевого продукта 2,67 г (96%). Перекристаллизовывают из воды, стараясь во избежание разложения тиурониевой соли предельно сократить время кипячения.

Данные рН-метрического титрования и элементного анализа.

Найдено: Экв₁ 269,0; Экв₂ 134,0; %С 14,04; %Н 4,01.

C₃H₁₀N₂P₂O₆S.

Вычислено: Экв₁ 264,0; Экв₂ 132,0; %С 13,64; %Н 3,82.

ПМР (Д₂О + Nа₂СО₃), δ.м.д.: 2,5, тт, J_нр = =21 Гц, J_нн = 7 Гц (1Н, СН); 3.8, тд, J_нр = 15 Гц, J_нн = 7 Гц (2Н, СН2).

31Р-ЯМР спектр (Д₂О + РУ): 16.4 м.д., тд, J³_рн = 21Гц, J²_рн= 15 Гц, при подавлении спин-спинового взаимодействия с¹Н-синглет.

Новое соединение относится к умеренно опасным, смертельная доза составляет L_D 300 мг/кг при в/б введении.

Концентрации вводимых животным или в инкубационную среду веществ подобраны экспериментальным путем. Важно, что в первые два дня после облучения вещества вводятся животным в концентрациях, сдерживающих митотические циклы и индуцирующих активность генов, чувствительных к сАМР, а на четвертый день после облучения - в концентрациях, благоприятных для включения клеток в митотический цикл. Концентрации веществ в среде для инкубации клеток костного мозга соответствуют условиям, останавливающим митотические процессы. Предлагаемая схема введения создает условия для восстановления системы репарации ДНК при одновременном торможении синтеза ДНК, индуцируемому неспаренными основаниями и приводящего к тому, что повреждения остаются нерепарированными.

Условия инкубации ККМ также определены экспериментально. Температурный интервал 29-31^о является наиболее благоприятным для сАМР-зависимых фосфотрансферазных реакций. Охлаждение ККМ проводят, чтобы снизить процент разрушения клеток при центрифугировании. 4-10^оС - наиболее оптимальная температура для осаждения клеток.

Все три варианта способа отработаны на мышах (СВАХС57В1/6)F₁ гибридах и мышах породы Swiss. Животных облучали на установке РУМ-17 при мощности дозы 0,9 Гр/мин. (фильтр А1, толщина 3 мм). 0 восстановлении ПСКК судили по числу колоний в селезенке на 10-15 дни по методу Till и Meculloch. Выживание животных оценивали по динамике гибели животных в течение 30 дней. Фосфотрансферазную активность сАМР-зависимых протенкиназ определяли по методу М. Нестеровой и соавторов. Полученные данные отработаны методом непараметрической статистики Вилконсона, Манна и Уитни на микро-ЭВМ "ДВК-3".

П р и м е р 1. Партию мышей (СВАхС57В1/6)F1гибридов облучают дозой 8,5 Гр. Извлеченные ККМ отмывают в среде Игла и помещают в инкубационную среду при концентрации (3-5)˙10⁶ клеток на 1 мл. Инкубационная среда содержит, мМ: трис. ацетат 30 (рН 6,0); хлористый натрий 150; ацетат магния 10; теофиллин в составе 2,4%-ого эуфиллина 5; гидрофторид калия 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту 5; глютатион окисленный 0,05; фосфорнокислый натрий однозамещенный (NaH₂PО₄) 0,1; АТР 0,05 и глюкозу 5,6 (0,1%). Среду доводят до рН 6,0 уксусной кислотой. Инкубирование проводят при осторожном перемешивании в течение одного часа при 29^оС. После инкубации ККМ охлаждают до 4^оС, отмывают в среде Игла и вводят облученным сингенным животным в/в в количестве 10˙10⁶ живых клеток.

Процент живых клеток после инкубации в данной среде составляет 78-85% по окраске 0,2% трипановым синим. Активность сАМР-зависимых протеинкиназ возвращается к норме.

Результаты по восстановлению ПСКК приведены в табл. 1. Влияние инкубации ККМ на фосфотрансферазную активность сАМР-зависимых протеинкиназ показаны в табл. 2.

Аналогичные результаты получены при инкубировании ККМ облученных животных в той же инкубационной среде в течение 1,5 ч при температуре 31^оС с последующим охлаждением клеток до 10^о.

П р и м е р 2. Предварительно готовят смесь следующего состава, мМ: трис-ацетат 30 при рН 6,0; хлористый натрий 150; ацетат магния 10. гидрофторид калия 5; теофиллин в составе 2,4%-ого эуфиллина 5; 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота 3; глютатион окисленный 0,5; АТР 0,25. Добавляют глюкозу до концентрации 10% (556 мМ) и полученную смесь доводят до рН 6,0 уксусной кислотой.

Партию мышей Swiss облучают дозой 8,5 Гр. Такой же дозой облучают мышей (СВАхС57ВL)F₁ гибридов. В день после облучения и через сутки облученным животным вводят данную смесь в/в в дозе 0,5 мл. Влияние воздействия смеси на процесс образования колоний в селезенке показано в табл. 3.

П р и м е р 3. Партию мышей как в примере 2 облучают дозой 8,5 Гр. Непосредственно после облучения животным вводят в/б в дозе 0,25 мл раствор сАМР в среде Игла в концентрации 0,1 мМ на 1 кг веса животного. Готовят смесь в среде Игла концентрации (мМ/кг): 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота 0,1; глютатион окисленный 0,1; АТР 0,1; теофиллин 8,8 и этилендиамин 6,6 (в составе 2,4%-го эуфиллина). Раствор нейтрализуют 1,3% -ым NaОН. Эту смесь в дозе 0,25 мл вводят животным в/б через 2 ч после введения сАМР и на вторые сутки после облучения. Затем готовят новую смесь в среде Игла в концентрации, мМ/кг: сАМР 0,005, глютатион окисленный 0,005; 2-Sтиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота 0,01; АТР 0,1; теофиллин 4,4 и этилендиамин 3,3 (в составе 2,4%-го эуфиллина). Эту смесь вводят животным на четвертые сутки после облучения в/б в дозе 0,25 мл.

Влияние воздействия внутрибрюшинного введения указанных веществ на процесс образования колоний в селезенке показано в табл. 3.

Результаты испытаний показывают, что инкубация ККМ летально облученных животных по варианту 1 восстанавливает не только фосфотрансферазную активность сАМР-зависимых протеинкиназ, но и увеличивает число стволовых клеток, способных образовывать колонии в селезенке. Можно говорить о восстановлении небольшого процента ПСКК в результате такого воздействия.

Варианты 2 и 3 позволяют достигнуть восстановления ПССК более простым путем, а именно введением в/в или в/б специально приготовленных смесей, основными компонентами которых являются: 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота, глютатион, АТР и эуфиллин. Выживаемость летально облученных животных согласно варианту 3 достигает 63%, что приближается к данным по выживанию животных после введения им криоконсервированных клеток костного мозга.

Использование: в ветеринарии, в частности в способах восстановления стволовых кроветворных клеток у облученных животных. Сущность изобретения: для повышения эффективности восстановления кроветворных клеток и сохранения жизни животного, облученного летальной дозой радиации, используют клетки костного мозга облученного организма, отмывают в среде Игла, инкубируют в течение 1 - 1,5 ч при 29 - 31 градусах Цельсия в среде, содержащей в качестве основных компонентов 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту, глютатион окисленный, аденозинтрифосфорную кислоту и эуфиллин, с последующим охлаждением до 4 - 10 градусов Цельсия, введением облученным животным внутривенно в количестве 10·10⁶ живых клеток. По другим вариантам облученным животным вводят внутривенно или внутрибрюшинно радиопротекторные смеси с указанными основными компонентами по специально разработанным схемам. 3 с.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ восстановления стволовой кроветворной клетки облученных животных, включающий введение вещества, активирующего процессы репарации ДНК и/или дифференцировки клеток иммунной системы, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа и сохранения жизни животных, в качестве активирующего вещества используют извлеченные из облученного организма клетки костного мозга, которые после отмывки в среде Игла инкубируют при температуре 29 - 31^oС в течение 1 - 1,5 ч в среде, имеющей pH 6,0 и содержащей, мМ: трис-ацетат 30; хлористый натрий 150; ацетат магния 10; гидрофторид калия 5; теофиллин 5; 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота 5; глютатион окисленный 0,05; аденазинтрифосфорная кислота (АТР) 0,05; фосфорнокислый натрий однозамещенный 0,1; глюкоза 5,6, причем теофиллин используют в составе 2,4%-го эуфиллина, а концентрация клеток в смеси составляет (3 - 5) · 10⁶ клеток на 1 мл, затем клетки костного мозга охлаждают до 4 - 10^oС и вводят облученным животным внутривенно в количестве не менее 10 · 10⁶ живых клеток. 2. Способ востановления стволовой кроветворной клетки облученных животных, включающий введение вещества, активирующего процессы репарации ДНК и/или дифференцировки клеток иммунной системы, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа и сохранения жизни животных, в качестве активирующего вещества используют смесь, имеющую pH 6,0 и содержащую, мМ: трис-ацетат 30, хлористый натрий 150, ацетат магния 10, гидрофторид калия 5, теофиллин 5, 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту 3, глютатион окисленный 0,5, АТР 0,25 и глюкозу 556, причем теофиллин используют в составе 2,4%-ного эуфиллина, которую вводят облученным животным внутривенно в день облучения и через сутки после него в дозе 0,5 мл. 3. Способ восстановления стволовой кроветворной клетки облученных животных, включающий введение веществ, активирующих процессы репарации ДНК и/или дифференцировки клеток иммуной системы, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа и сохранения жизни животных, в качестве активирующих веществ облученным животным вводят внутрибрюшинно в дозе 0,25 мл непосредственно после облучения аденозин-3, 5-монофосфат в дозе 0,1 мм на 1 кг массы животного, а по истечении 2 - 3 ч и на следующий день после облучения - смесь, содержащую, мМ/кг: 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту 0,1, глютатион окисленный 0,1, АТР 0,1, теофиллин 8,8 и этилендиамин 6,6 внутрибрюшинно в дозе 0,25 мл, и на четвертые сутки после облучения - смесь, содержащую, мМ/кг: аденозин-3', 5'-монофосфат 0,005, глютатион окисленный 0,005, 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту 0,01, АРТ 0,1 теофиллин 4,4 и этилендиамин 3,3, причем все вводимые вещества растворяют в среде Игла, добавляя 1 - 3% раствор гидроокиси натрия до pH 7,0 - 7,4, а теофиллин и этилендиамин используют в составе 2,4%-го эуфиллина, причем смесь вводят внутрибрюшинно в дозе 0,25 мм.