СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОСТНО-МОЗГОВОГО ИНГИБИТОРА ПРОЛИФЕРАЦИИ СТВОЛОВЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК Российский патент 1998 года по МПК A61K35/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам получения препаратов из костного мозга, в частности негативных регуляторов гемопоэза.

Начало поискам способов получения негативных регуляторов гемопоэза из клеток костного мозга (ККМ) было положено Б.И.Лордом (Манчестер, Англия) в 1976 году, получившим экстракт из нормальных костно-мозговых клеток свиньи - NBME. Способ включал ультрафильтрацию экстракта на мембранах Amicon Diaflo с получением фракции 50-100 кД. (Negative regulators of hematopoiesis Annals of the New-York Academy of sciences, vol. 628, 1991, p. 44-51).

Известен способ получения ингибитора пролиферации стволовых кроветворных клеток из макрофагальных клеток костного мозга (PCT 89/10133, A 61 K 37/02, 1989). Данным способом получают макрофагальный воспалительный белок (Mip 1α) с молекулярным весом 8 кД, ингибирующий циклирование ранних кроветворных предшественников из костного мозга мыши (KOE-C). В способе используются эффективные сорбенты - гепарин и блусефароза, с помощью которых достигается 50000-кратная очистка продукта. Данный способ требует использования дорогостоящих сорбентов, что не позволяет получать препаративные количества ингибитора.

Известен способ выделения ингибитора из экстракта костного мозга теленка, включающий очистку экстракта хроматографией на биогеле. Данный ингибитор подавляет синтез ДНК и пролиферацию стволовых кроветворных клеток (Guigon M. , Paukovits W.R. Protection of bone marrow during chmotheray by peptides inhibiting hematopoietic stem cell proliferation, Fac. de Med. St. Antonie, Paris, Франция, в кн. : Структура и функции иммунорегуляторных пептидов, ВИНИТИ, сер. Иммунология, т. 26. - М.: 1988, 206-212). Данный способ позволяет получить тетрапептид формулы acetyl-N-Ser-Asp-Lys-Pro, (AcSDKP), обладающий свойством ингибировать пролиферацию ранних гемопоэтических предшественников (KOE-C). Его молекулярный вес составляет примерно 500 Д. Мишенью действия ингибитора являются KOE-C, находящиеся в фазе клеточного цикла G₀, в то время как на клетки, находящиеся в периоде синтеза ДНК (S) или в периоде G₁ - S AcSDKP, не действует.

Наиболее близким к заявляемому с точки зрения функциональной активности (ингибиция пролиферации ранних предшественников гемопоэза KOE-C) является способ получения костно-мозгового ингибитора пролиферации стволовых кроветворных клеток путем получения клеток костного мозга из свиных ребер, центрифугирования и ультрафильтрации с целью удаления костного жира, последующим фракционированием через мембраны Amicon FM-50 и XM-100. Ультрафильтрация позволяет выделить фракцию с молекулярным весом 50-100 кД. При этом происходит обогащение в 5 раз. Полученный продукт содержит смесь полипептидов и поэтому негомогенен. В дальнейшем продукт подвергали хроматографической очистке гель-фильтрацией на Sephadex G-25. Максимальную ингибиторную активность выявляли во фракции, содержащей продукт с молекулярной массой 17 кД, который был использован как ингибитор пролифератиавной активности KOE-C (Орловская И. А. и др. Изменения в возрастной структуре стволовых кроветворных клеток старых мышей под влиянием фактора, ингибирующего их пролиферативную активность. Онтогенез, 1994, т. 25, N 3, с. 27). Недостатком известного способа является малый выход и гетерогенность целевого продукта. Кроме того, использование импортных реактивов и материалов приводит к значительному удорожанию способа.

Задача изобретения состоит в повышении выхода, удельной активности и достижении гомогенности целевого продукта, а также удешевлении схемы очистки за счет использования отечественных сорбентов, реактивов и материалов.

Задача решается в изобретении тем, что в способе получения костно-мозгового ингибитора пролиферации стволовых кроветворных клеток, включающем получение клеток костного мозга и центрифугирование, выделенный клеточный экстракт перед центрифугированием прогревают при 40-80^oC в течение 10-60 мин, охлаждают и центрифугируют со скоростью 3000-6000 об/мин, полученный экстракт охлаждают на льду, осаждают ацетоном и растворенный осадок хроматографируют на колонке с обращенно-фазовым сорбентом в системе с трифторуксусной кислотой в градиенте ацетонитрила.

Способ выполняется следующим образом. Ребра свиных туш зачищают от мышечных волокон и жира, разрезают на куски гидропрессом, например, марки "Биофизприбор", и вымывают костный мозг физиологическим раствором. Грубый экстракт осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение примерно 20 мин.

Фильтрат помещают в водяную баню с температурой 40-80^oC на 10-60 мин. После охлаждения смесь центрифугируют на центрифуге со скоростью 3000-6000 тыс. об/мин. Осадок отделяют декантацией.

Полученный экстракт охлаждают на льду и по каплям в течение 10-60 мин приливают к охлажденному до 200^oC ацетону. Для более полного осаждения берут 9 объемов ацетона. Полученную суспензию выдерживают на холоде (-20^oC) в течение 10-20 ч. Выпавший осадок центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин недостаточную жидкость сливают.

Полученный осадок растворяют в уксусной кислоте. Смесь полипептидов, обогащенную ингибитором, хроматографируют с использованием колонки с обращенно-фазовым сорбентом марки Полисил ОДС, C-18, размер гранул 10 мк.

Условия хроматографии:
Растворитель A: 10%-ный ацетонитрил в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте.

Растворитель Б: 90%-ный ацетонитрил в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте.

Элюция производится в условиях линейного градиента, время элюции - 50 мин. Скорость элюента: 1 мл/мин.

Время выхода пика активного вещества - 40-45 мин.

Пример 1. 50 мл суспензии клеток костного мозга в физиологическом растворе прогревают на водяной бане при 50^oC в течение 40 мин и затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Осветленный раствор декантируют от осадка. Полученные 35 мл экстракта охлаждают во льду, по каплям в течение 30 мин приливают к 300 мл охлажденного ацетона и оставляют на холоде на 4-20 ч. Выпавший осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 40 мин. Надосадочную жидкость декантируют, осадок промывают на фильтре ацетоном, охлажденном до -20^oC.

Осадок высушивают на воздухе и растворяют в стартовом буфере для хроматографии, концентрация белка - 10 мг/мл.

Для фракционирования полученного раствора, содержащего целевой фактор, используют обращенно-фазовый сорбент Ультрасфера ОДС, с размером частиц 10 мк в системе элюции с ацетонитрилом в присутствии 0,1%-ной трифторуксусной кислоты на колонке размером 4,6 мм х 20 см. Выделяют фракцию, обладающую наибольшей активностью. Целевой продукт выходит при концентрации 80%-ного ацетонитрила. Выделенную фракцию упаривают на роторном испарителе и растворяют в дистиллированной воде.

Данные электрофореза и хроматографии показывают, что выделенный продукт на 95% состоит из полипептида с молекулярной массой 16 кД. В результате очистки удельная активность препарата увеличивается по сравнению с исходным экстрактом в 4000 раз.

Пример 2. 200 мл суспензии клеток костного мозга в физиологическом растворе прогревают на водяной бане при 60^oC в течение 60 мин и затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Осветленный раствор декантируют от осадка. Полученный супернатант охлаждают во льду, по каплям в течение 30 мин приливают к 9-кратному объему охлажденного ацетона и оставляют на холоде на 4 ч. Надосадочную жидкость декантируют, осадок промывают на фильтре ацетоном, охлажденном до -20^oC.

Осадок высушивают на воздухе и растворяют в стартовом буфере для хроматографии, концентрация белка - 10 мг/мл.

Для фракционирования используют сорбент и элюенты как и в примере 1, размер колонки 2х25 см. Фракция, обладающая наибольшей активностью, элюируется при 60-80% ацетонитрила. Выделенный продукт упаривают на роторном испарителе или лиофилизуют.

Данные электрофореза и хроматографии показывают, что полученное биологически активное вещество очищено по сравнению с исходной смесью в 24 раза. Выделенный продукт представляет собой смесь двух полипептидов с близкими молекулярными массами 16 кД.

При выполнении способа по данному изобретению активность целевого продукта оценивали по ингибиции митотической активности KOE-C по включению меченого ³H-тимида. Использовали методику "тимидинового самоубийства", основанную на том, что радиоактивно меченный предшественник ДНК, ³H-тимидин, обладающий высокой удельной радиоактивностью, включается только в клетки, которые находятся в фазе синтеза ДНК (S) и повреждают их. Суспензию клеток костного мозга (ККМ) мышей-доноров, в концентрации 2•10⁷ клеток в 1 мл преинкубировали в течение 4 ч с ингибитором, а затем с ³H-тимидином в концентрации 250 мкКи/мл в течение 30 мин при 37^oC. Предварительно мышам-донорам за сутки до взятия ККМ был введен тестостерон-пропионат, вызывающий повышение пролиферации стволовой кроветворной клетки до 30-35% KOE-C, находящейся в S - фазе. Часть суспензии инкубировали с ингибитором в тех же условиях, но без добавления ³H-тимидина. Для прекращения включения тимидина суспензию после инкубации центрифугировали с добавлением охлажденной среды 199, после чего клетки (10⁵ в 1 мл) вводили внутривенно по 0,5 мл сингенным летально облученным реципиентам. На 9 сутки определяли в селезенках этих мышей количество колоний, каждая из которых образуется из одной стволовой кроветворной клетки. Процент KOE-C, находящихся в S- фазе клеточного цикла, вычисляли по формуле:

где
a - число колоний, образуемых костным мозгом без ³H-тимидина;
b - число колоний, образуемых после инкубации с ³H-тимидином;
P - процент KOE-C.

Например, преинкубация ККМ, полученных от мышей, обработанных тестостероном пропионатом, с ингибитором в дозе 5•10^-5 мкг/мл вызывает снижение пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток с 34,6% KOE-C, находящихся в фазе синтеза ДНК (S) до 0%. Активность препарата, полученного предложенным способом, составляет 24,5% при дозе ингибитора 2•10^-2.

Использование: в способах получения препаратов из костного мозга, в частности негативных регуляторов гемопоэза. Технический результат: повышение выхода, удельной активности и гомогенности целевого продукта. Сущность изобретения: в способе получения костно-мозгового ингибитора пролиферации стволовых кроветворных клеток, включающем получение клеток костного мозга и центрифугирование, выделенный клеточный экстракт перед центрифугированием прогревают при 40-80^oС в течение 10-60 мин, охлаждают и центрифугируют со скоростью 3000-6000 об/мин, полученный экстракт охлаждают на льду, осаждают ацетоном и растворенный осадок хроматографируют на колонке с обращенно-фазовым сорбентом в системе трифторуксусной кислотой в градиенте ацетонитрила.

Способ получения костно-мозгового ингибитора пролиферации стволовых кроветворных клеток, включающий обработку костного мозга млекопитающих физиологическим раствором, отделение суспензии клеток центрифугированием с последующей очисткой целевого продукта хроматографией, отличающийся тем, что суспензию клеток прогревают при 40 - 80^oС в течение 10 - 60 мин, охлаждают, центрифугируют при 3000 - 6000 мин^-1, супернатант охлаждают на льду, обрабатывают ацетоном, собирают осадок, содержащий целевой продукт, растворяют и хроматографируют на колонке с обращенно-фазовым сорбентом в системе с трифторуксусной кислотой в градиенте ацетонитрила.