ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 1998 года по МПК A61K31/475 G01N33/53 

Изобретение относится к иммуномодуляторам и может быть использовано в медицине для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушением иммунитета.

В настоящее время существуют данные о том, что одним из ведущих механизмов развития аутоиммунных нарушений является активация T-клеток хелперов, сопровождающаяся увеличением продукции ростовых факторов для B-клеток, синтезом аутоантител, развитием иммунокомплексных нарушений в органах [1]. При этом представляется, что целенаправленная иммунокоррекция аутоиммунного синдрома должна быть связана с нормализацией функций T хелперов. Именно с избирательным T-лимфотропным действием связан терапевтический эффект левамизола - гетероциклического соединения (-)2,3,5,6-тетрагидро-6-финилимидазо-[2,1-b] -тиазола гидрохлорида, который может выполнять функцию иммуномодулятора, способного усиливать слабую реакцию клеточного иммунитета, ослаблять сильную и не действовать на нормальную. Левамизол как иммуностимулирующий препарат применяется с осторожностью, так как возможно не только иммуностимулирующее, но и иммунодепрессивное действие.

Кроме того, препарат может вызывать различные побочные явления вплоть до аллергических кожных реакций и агранулоцитоза [2].

Цель изобретения - поиск новых соединений, обладающих способностью регулировать клеточные механизмы иммунной системы.

Задачей изобретения является установление иммуномодулирующих свойств нового гетероциклического соединения трис-(2-гидроксиэтил) аммоний индолил-3-тиоацетат формулы
,
или препарат ВМ-2-84.

Препарат получен взаимодействием индолил-3-тиоуксусной кислоты с триэтаноламином в этаноле при 70^oC и соотношении реагентов 1:1 при нагревании в течение 5 мин по схеме
Исследуемое соединение представляет собой слегка окрашенное в желтоватый цвет кристаллическое вещество со слабым запахом, неограниченно растворяющееся в воде, растворяется в спирте, ацетоне и диоксане водных, не растворяется в эфире, углеводородах.

Состав и строение его доказаны методом ИК-спектроскопии, элементным анализом. В ИК-спектре ВМ-2-84 содержатся полосы поглощения в области 1610(COO^-), 3230(NH-гетерил), 3300 (N⁺H), 2990(CH-алкил), 3430(OH) см^-1.

Способ получения заявленного соединения основан на доступном промышленном сырье - крупнотоннажном продукте-триэтаноламине и доступной индидолил-3-тиоуксусной кислоте, являющейся полупродуктом для синтеза практически ценных соединений. Он прост в исполнении, не требует применения катализаторов, специального оборудования, растворителей дорогих и дефицитных, выделение целевого продукта осуществляется известными приемами с высоким выходом. Способ получения легко может быть воспроизведен в промышленном масштабе.

Пример 1. Синтез трис-(2-гидроксиэтил) аммоний индоли-3-тиоацетата.

20,7 г (0,01 моль) индолил-3-тиоуксусной кислоты растворяют в 100 мл сухого этилового спирта и к раствору приливают раствор триэтаноламина 14,9 г (0,1 моль) в 15 мл спирта. При этом наблюдается саморазогревание. Затем реакционную смесь нагревают до кипения 70^oC, выдерживают при 70^oC мин и охлаждают до 15^oC. К охлажденному раствору приливают при перемешивании 200 мл сухого эфира и перемешивание продолжают до полной выкристаллизации целевого продукта. Выход 32,04 г (90%). T плавления 92-93^oC. Найдено, %:C 53,90; H 7,10; N 7,76; S 9,02. C₁₆H₂₄N₂O₅S. Вычислено, %:C 53,91; H 6,79; N 7,86; S 8,99.

Изучение токсичности ВМ-2-84;б проведено на беспородных белых мышах весом 20 - 22 г при внутрибрюшинном, внутрижелудочном введении препарата. Изучалось резорбтивное действие препарата и хроническая токсичность. При внутрибрюшинном введении LD_5--3000 мг/кг, при введении через рот LD_5--4466 (3937 - 5001) кг/кг. Вещество не обладает кожно-нарывным и резорбтивным действием. В хроническом опыте при длительном применении препарата ВМ-2-84 в течение 5 мес в дозах 40 и 70 мг/кг отмечены определенные изменения в тканях сердца, печени, легких, почках, которые менее заметны в структурах коры головного мозга и селезенке белых мышей при сравнении с контролем.

В хроническом опыте при введении препарата в дозе 10 мг/кг не выявлено отклонений в тканях органов животных.

Таким образом, предлагаемое соединение относится к практически нетоксичным соединениям.

Иммуномодулирующий эффект ВМ-2-84 изучали на лимфоидных клетках мышей разных генотипов, клетках крови здоровых людей по способности влиять на:
спонтанную, митоген- и антигениндуцированную пролиферацию T и B-лимфоцитов мышей и людей в культуре in vitro;
IgM антителообразование in vivo;
гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ).

I. Митоген-индуцированную пролиферацию T-лимфоцитов мышей и человека оценивали по ответу на конканавалин A Con A, антиген-индуцированную пролиферацию T-лимфоцитов мышей - в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов MLC. Пролиферацию B спленоцитов оценивали по ответу на ЛПС, B лимфоцитов людей - по ответу на митоген лаконоса (МЛ)
Для постановки культуры клеток in viteo стерильно готовили суспензию клеток тимуса и селезенки мышей, содержащую 2•10⁶ клеток/мл в полной культуральной среде, состоящей из RPMI 1640, дополненной 10% фетальной сыворотки, 10 мМ HEPES, 0,04 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ глютамина, 50 мкг/мл гентамицина. Реакцию проводили в 96-лучных планшетах (Ленинградский з-д мед. полимеров). Каждая проба выполнялась в триплетах. Конечная концентрация Con A (Pharmacia) составила 5, 10, 25 мкг/мл, использовали и субоптимальные дозы митогена - 0,5 и 1 мкг/мл. Конечная концентрация ЛПС E.Colli В5:055 составила 50, 100, 200 мкг/мл. Растворы ВМ-2-84 готовили на RPMI 1640 и вносили в культуру одновременно с Con A через 4, 24, и 48 ч от начала культивирования в конечных концентрациях 5, 50 и 250 мкг/мл. Результаты пролиферации на Т-клеточный митоген оценивали через 72 ч, на В клеточный митоген - через 120 ч по включению ³H тимидина, вносимого в дозе 1 мкКи/лунку за 4 ч до окончания культивирования. Оценку данных проводили как в абсолютных значениях (имп/мин), так и по индексу стимуляции (ИС):опыт им/мин/контроль имп/мин.

При этом установлено, что ВМ-2-84 подавляет спонтанную (на 35 - 45%) и Con A индуцированную пролиферацию спленоцитов. Подавление митоген-индуцированной пролиферации спленоцитов при оптимальной дозе митогена (10 мкг/мкг) носило дозозависимый характер (фиг. 1). Подавление спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации при оптимальной дозе митогена наблюдали на тимоцитах и спленоцитах мышей гибридов F1 двух видов: (C57BL/6•DBA/2)F1 и (CBA•C57BL/6)F1 (фиг. 2). Отчетливые иммунодепрессивные свойства ВМ-2-84 обнаружены в отношении антиген-индуцированной пролиферации Т-клеток в MLC (фиг. 3).

Данные о влиянии ВМ-2-84 на спонтанную и Con A-индуцированную пролиферацию Т клеток крови здоровых лиц представлены в табл. 1.

Как видно из данных таблицы, ВМ-2-84 оказывает достоверное ингибирующее влияние на митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов здоровых людей.

В описанных выше опытах препарат вносили in vitro в культуру клеток человека и мышей. Как видно из данных, представленных на фиг. 2, наблюдали также подавление спонтанной и митген-индуцированной пролиферации тимоцитов и спленоцитов мышей после введения ВМ-2-84 in vivo (внутрибрюшного) в дозе 50 мг/кг.

Данные о влиянии ВМ-2-84 на пролиферацию В-клеток крови здоровых лиц под действием МЛ представлены в табл. 2.

Как видно из данных табл.2, ВМ-2-84 не оказывает существенного влияния на митоген-индуцированную пролиферацию Т-клеток крови здоровых лиц.

Как видно из фиг. 5, ВМ-2-84 либо не оказывает влияния на ЛПС-стимулированную пролиферацию В спленоцитов (при оптимальной дозе митогена), либо стимулирует ее (при субоптимальной дозе ЛПС).

Таким образом, анализируя представленные данные о влиянии ВМ-2-84 на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов мышей и людей, можно отметить отчетливое действие препарата. Важно отметить, что подавление пролиферации Т-клеток ВМ-2-84 не связано с нарушением жизнеспособности этих клеток.

Авторами установлено:
жизнеспособность Т лимфоцитов мышей под действием ВМ-2-84 не снижается;
в опытах по определению лимфотоксического действия ВМ-2-84 на модели инактивации эндогенных стволовых кроветворных клеток аллогенными Т-лимфоцитами установлено, что ВМ-2-84 не обладает лимфотоксическими свойствами.

II. Влияние ВМ-2-84 на первичный гуморальный иммунный ответ (АОК) оценивали методом локального гемолиза по способности клеток селезенки продуцировать IgM антитела к эритроцитам барана (ЭБ) у интактных мышей линии С57BL/6 и (С57BL/6•DBA/2)F1 6 - 8-недельного возраста, полученных из питомника "Столбовая". Контрольные и опытные группы состояли не менее, чем из 10 мышей. ВМ-2-84 вводили в различных внутрибрюшинно, контрольным мышам в таком же объеме вводили растворитель (воду). Через 2 ч после последнего введения препарата мышей иммунизировали внутривенно 2•10⁸ЭБ в объеме 0,5 мл. На 4-е сут после иммунизации животных забивали и определяли количество АОК по числу гемолитических бляшек модифицированным методом локального гемолиза в полужидкой среде [7]. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, введение мышам С57BL/6 и B6D2F1 препарата ВМ-2-84 обнаруживает дозозависимое стимулирующее действие на гуморальный иммунный ответ на тимус-зависимый антиген.

III. Влияние соединения ВМ-2-84 на клеточный иммунный ответ оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ): величины отека лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным, которым до сенсибилизации вводили ВМ-2-84. При этом оценивали эффект соединения на продуктивную фазу ГЗТ. Для сенсибилизации мышам вводили внутрибрюшинно 0,5 мл 0,5%-ного р-ра ЭБ. На 4-е сут под апоневроз задней лапы вводили разрешающую дозу ЭБ - 0,05 мл 50% ЭБ, в противоположную лапу - 0,05 мл среды 199. Через 24 ч производили учет реакции по отечности стопы в мм.

При этом было установлено, что трехкратное введение ВМ-2-84 интактным мышам B6D2F1 в дозе 50 мг/кг вызывает более, чем двухкратное подавление ГЗТ; выраженность отека лапы, в которую вводили разрешающую дозу антигена, у контрольных животных составила 47%, у мышей, предварительно получавших ВМ-2-84, выраженность отека составила 21,9%.

Таким образом, анализируя данные о влиянии ВМ-2-84 на интактных мышей B6D2F1, необходимо отметить его оппозитное влияние на АОК и ГЗТ; в дозе 50 мг/кг он стимулирует АОК и подавляет ГЗТ, что косвенно можно расценить как преимущественное влияние на выработку Th1 и/или Th2 соответственно цитокинов ИЛ-2 (определяющего развитие клеточного иммунного ответа) и/или ИЛ-4 (определяющего антителообразование).

Таким образом, на основе доступного химического сырья синтетическим путем с высоким выходом получен водорастворимый высокоактивный, нетоксичный новых иммуномодулятор - трис-(2-гидрооксиэтил) аммоний индолил-3-тиоацетат. Учитывая его избирательное Т-лимфотропное действие, предлагаемый препарат может быть использован для создания лекарственного средства для лечения широкого круга заболеваний, связанных с нарушением иммунитета.

Литература
1. Hahn B.K., Ando D. et. ak. Amer. J. Immunol., 1988, 85, 32 - 34.

2. Машковский М. Д. Лекарственные средства, М., Медицина, 1988, ч. 2, 169-170.

3. Заявка Великобритании N 2093693, кл. A 61 K 31/205; C 07 C 59/64; C 07 D 209/128. Ciba-Geigy АО (Великобритания), приор. 24.02.81.

4. Заявка США N 4556672, кл. A 61 K 31/40; C 07 D 209/304, Pfizer Inc. (США), приор. 19.03.84.

5. Заявка СССР N 1401850, кл. A 61 K 31/40; C 07 D 209/30. Иркутский институт органической химии СО АН СССР, приор. 18.07.86.

6. Kimball P.M., Kerman R.H. et. al. Transplantation. 1991, 52, 2, 486 - 490.

7. Cunningham A.J., Szenberg A. Immuunol. 1968, 15, 559 - 606.0

Использование: в медицине для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушением иммунитета. Сущность изобретения: предлагаемый иммуномодулятор представляет собой трис-(2-гидрокси\этил)\аммоний\ индолил-3-тио\ацетат и является водорастворимым, высокоактвным, нетоксичным препаратом, обладает выраженным Т-лимфотропным действием наряду с отсутствием лимфотоксических свойств, позволяет расширить арсенал иммуномодулирующих средств. 5 ил., 3 табл.

Иммуномодулятор, представляющий собой гетероциклическое соединение, отличающийся тем, что в качестве гетероциклического соединения он содержит трис-(2-гидроксиэтил)аммоний-индолил-3-тиоацетат формулы
л