СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ СОЕДИНЕНИЯ WS7622A Российский патент 1994 года по МПК C07G17/00 

Изобретение относится к производным нового вещества, обозначенного WS 7622А.

Более конкретно изобретение относится к производным нового вещества WS 7622А, обладающим ингибирующим действием на лейкоцитэластазу человека.

Вещество WS 7622А может быть получено культивированием в питательной среде штаммов рода Streptomyces продуцирующих вещество WS 2722А.

Микроорганизм, который может быть использован для получения вещества WS 7622А, относится к продуцирующим это вещество штаммам, принадлежащим к роду Streptomyces, среди которых и недавно выделенный из образца почвы, собранной в Хироно-хо, Фукушима-кен (Япония), штамм Streptomyces resistomycificus N 7622.

Лиофилизованный образец недавно выделенного Streptomyces resistomycificus N 7622 первоначально депозитирован при участии Международного депозитарного Агентства согласно Будапештскому соглашению Исследовательским институтом ферментации, Агентство промышленных наук и технологии (1-3, Хигаши I хоум, Цукуба-ши, Ибараки-кен, 305 Япония) под регистрационным номером ГЕРМ ВР-2306 (дата депозитирования - 23.02. 1989), но затем этот штамм получил наименование Streptomyces resistomycificus N 7622.

Необходимо указать, что получение нового вещества WS 7622А, не ограничивается использованием конкретного описываемого здесь микроорганизма, который приводится только с целью иллюстрации. Изобретение также включает применение любых мутантов, способных продуцировать вещество WS 7622А, в том числе природных мутантов также как и искусственных мутантов, созданных из описанного микроорганизма обычными средствами, такими как облучение рентгеновскими лучами, облучение ультрафиолетом, обработка N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином, 2-аминопурином и т.п.

Производные соединения WS 7622А изобретения могут быть представлены формулой I
C₄₇H₆₁N₉O где R - метил или ацетил.

Производные вещества WS 7622А и их фармацевтически приемлемые соли обладают ингибирующей активностью по отношению к лейкоцитэластазе человека и применимы в качестве ингибиторов лейкоцитэластазы человека для лечения таких заболеваний, например, как эмфиземы легких, атеросклероза, ревматоидного артрита, остеоартрита, псориаза, панкретида, респираторного дистресссиндрома у взрослых и т.д.

Для иллюстрации применимости производных WS 7622А и их фармацевтически приемлемых солей ниже приведены данные фармакологических испытаний.

Опыты с ингибированием протеазы
(1) Получение грубой лейкоцитэластазы человека.

У здорового добровольца отбирают 50 мл крови. Использованием Моно-Поли разрешающей среды (ФЛОУ Лабораториз, Австралия) отделяют лейкоциты, которые собирают центрифугированием. Оставшиеся эритроциты лизируют добавлением дистиллированной воды с осаждением и центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин. К полученному осадку добавляют 10 мл 2 М NaClО₁₀ и экстрагируют эластазу. После экстрагирования в течение 120 мин при 0^оС центрифугированием получают жидкую часть с эластазной активностью. После добавления к жидкой части равного объема хлороформа и интенсивного всряхивания отделяют прозрачный раствор с эластазной активностью. Прибавляют 10 мл HEPES-буфера и используют в ферментативных испытаниях.

(2) Методика.

В ходе испытания используют 0,1 М HEPES-буфер (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота), содержащий 0,5 M NaCl, рН 7,5. В ячейках пластины для микротитрования с 96 ячейками смешивают двадцать пять мкл 2 мМ раствор метоксисукцинил-(Ala)₂-Pro-VaI-n-нитроанилида (100 мМ раствор в диметилсульфоксида, разбавленный буфером с 50 мкл образца, 10 мкл образца в органическом растворителе разбавляют в 5 раз буфером). С помощью микропластинчатого считывающего устройства (Корона Электрик Ко, Ибараки, Япония) измеряют поглощение смеси при длине волны 415 нм. После измерения добавляют 25 мкл препарата эластазы мокроты человека (ЭПЧ) в концентрации 6 мкг/мл или 25 мкл препарата лейкоцитэластазы человека и останавливают на 30 мин при комнатной температуре. После этого измеряют поглощение при 415 нм. Процент ингибирования лекарством определяют по формуле: 100х(1-"r" в присутствии ингибитора) "r" в отсутствии ингибитора), где "r" - поглощение после 30-минутного инкубирования минус поглощение перед добавлением фермента. Действие ингибиторов на другие протеазы определяют аналогично использованием N-сукцинил-b(Ala)2-n-нитроанилида для эластазы поджелудочной железы свиньи (тип IV, конечная концентрация 5 мкг/мл), N-альфа-бензоил-Aro-n-нитроаналида для трипсина поджелудочной железы быка (Тип I, конечная концентрация 16 мкг/мл) метоксисукцинил-(Ala)2-Pro-MeI-n-нитроанилида для химотрипсина поджелудочной железы быка (Тип II, конечная концентрация 1,5 мкг/мл)) и катепсина G мокроты человека (конечная концентрация 10 ед/мл). ЭМЧ и катепсин G получены от Эластин Продакст Сомпени Инк., шт. Монтана, США. Все другие субстраты и протеазы поставлены фирмой Сигма Кемиклз Ко.

(3). Результаты.

1) Ингибирующее действие производных вещества WS 7622А на лейкоцитэластазу человека
Соединение по примеру
1 0,0103 мкг/мл
2 0,0103 мкг/мл
Каждая величина выражена в виде 50%-ной ингибирующей концентрации.

Сравнительный текст на подавляющее действие заявленных соединений и α₁-антитрипсина на человеческую лейкоцитарную эластазу проводят способом, описанным выше. Данные приведены в таблице.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть использованы в обычных фармацевтических формах, таких как: порошки, мелкие гранулы, гранулы, таблетки, драже, микрокапсулы, капсулы, свечи, растворы, суспензии, эмульсии и т.п. При желании в такую композицию могут быть добавлены разбавители и размельчители (например, сахароза, лактоза, крахмал, кристаллическая целлюлоза, низкозамешенная гидросипропилцеллюлоза, искусственный алюмосиликат и т. д.), связующие средства (например, целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, полипропилпирролидон, поливинилпирролидон, желатин, гуммиарабик, полиэтиленгликоль и т.д.), красители, подслащивающие вещества, смазки (например, стеарат магния и т.д.).

Дозировка композиции изобретения зависит от возраста, веса, состояния и т.д. больного, и, как правило, ее вводят перорально в ежедневных дозировках 100 мг - 10 г в пересчете на целевое соединение или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно 1-5 г с интервалом 1-3 раза в день. Обычная единичная доза может включать 50 мг, 100 мг, 200 мг, 500 мг, 1 г и т.п., хотя это только примеры и, разумеется, неограничительные.

П р и м е р 1 (получение диметилированного вещества WS 7622А, R₁-R₂ - метил).

К раствору вещества WS 7622А (1 г) в смеси хлороформа (20 мл) с метанолом (20 мл) добавляют триметилсилилдиазометан (4 мл, 10 мас.% в гексане, производство Петрарх системс Ко, Лтд.) и раствор оставляют примерно на сутки при комнатной температуре. Последующим испарением раствора досуха получают масло, которое очищают колоночной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью хлороформ - метанол (95:5). Содержащие продукт фракции соединяют и испаряют досуха. Промыванием полученного белого остатка диэтиловым эфиром получают 0,62 г диметилированного вещества WS 7622А в виде белого порошка.

Внешний вид - белый порошок.

Молекулярная формула C₄₉H₆₇N₉O₁₃.

FAB-MSm/Z : 990 (М + Н)⁺
(ТСХ) пластинка с силикагелем (Мерк Арт 5715)
хлороформ-метанол (5:1 об/об) Rf 0,72
хлороформ-метанол (9:1 об/об) Rf 0,40
Удельное вращение [α ]_D²³ + 37^o (c = 1,6, CHCl_3-MeOH (1:1)
ИК-спектр (нюджол) ν_max : 3400, 3250, 1730, 1660, 1640, 1540, 1520, 1330, 1260, 1210, 1180, 1160, 1100, 1080, 1000, 980, 920 см^-1.

¹Н-ЯМР-спектр (400 МГц, CD₃OD) δ: 7,2-7,11 (3Н, м), 6,93 (1Н, с), 6,83 (1Н, , к, J = 7 Гц), 6,77 (2Н, д, J = 8 Гц), 6,59 (1Н, с), 5,48 (1Н, м), 5,15 (1Н, м), 4,85 (1Н, с), 4,76 (1Н, м), 4,67 (1Н, м), 4,42 (1Н, м), 3,88-3,89 (2Н, м), 3,82 (3Н, с), 3,81 (3Н, с), 3,66 (3Н, м), 3,55 (1Н, м), 3,02 (1Н, м), 2,95 (3Н, с), 2,9 (1Н, м), 2,6-1,94 (5Н, м), 1,82 (1Н, м), 1,77 (3Н, д, J = 7 Гц), 16,8-1,58 (4Н, м), 1,46 (3Н, д, J = 7 Гц), 1,13 (3Н, д, J = 6 Гц), 1,12 (3Н, д, J 6 Гц), 1,01 (3Н, д, J = 6 Гц), 0,96 (3Н, д, J = 6 Гц), 1 (1Н, м).

П р и м ер 2 (получение диацетилированного вещества WS 7622А (R₁ = R₂ - ацетил).

К раствору вещества WS 7622А (1 г) в пиридине (5 мл) добавляют уксусный ангидрид (0,24 мл) и смесь оставляют примерно на сутки при комнатной температуре. Последующим испарением смеси получают масло, которое очищают колоночной хроматографией на силикагеле с элюированием смесью хлороформ-метанол (95: 5). Перекристаллизацией из горячей метанола с изопропиловым эфиром получают 0,73 г диацетилированного вещества WS 7622А в виде белого порошка. Внешний вид - бесцветные призмы.

Молекулярная формула C₅₁H₆₇N₉O₁₅.

FAB-MSm (Z : 1046) (М+Н)+.

Тонкослойная хроматография (пластинка с силикагелем, Мерк Арт 5715), хлороформ-метанол (5:1 об/об) Rf 0,73.

хлоpофоpм-метанол (9:1 об/об) Rf 0,40.

Удельное вращение ([α]_D²³ + 29^o)c = 1, CHCl_3-MeOH (1:1))
ИК-спектр (нюджол) ν_max: 3400, 1770, 1730, 1660, 1640, 1540, 1420, 1340, 1260, 1210, 1080, 1010, 980, 920 см^-1.

¹Н-ЯМР-спектр (400 МГц, DMCO-d6) δ: 9,48 (1Н, уширенный сигнал), 8,37 (1Н, д, J = 8 Гц), 7,76 (1Н, д, J = 7 Гц), 7,23-7,1 (4Н, м), 7,18 (1Н, с), 7,03 (1Н, д, J 9 Гц), 6,93 (1Н, с), 6,76 (2Н, д, J = 8 Гц), 6,74 (1Н, уш. с), 6,65 (1Н, к, J = 7 Гц), 5,74 (1Н, м), 5,42 (1Н, м), 5,08 (1Н, м), 4,77 (1Н, к, J = 10 Гц), 4,64 (1Н, м), 4,57 (1Н, м), 4,42 (1Н, м), 3,92-3,78 (2Н, м), 3,49 (1Н, м), 3,34 (1Н, м), 2,9 (1Н, дв.д. J = 13 и 12 Гц), 2,8 (3Н, с), 2,7 (1Н, м), 2,6 (1Н, дв.д, J = 13 и 11 Гц), 2,54 (1Н, септет, J = 6 Гц), 2,42-2,27 (2Н, м), 2,27 (3Н, с), 2,25 (3Н, с), 2,17 (1Н, м), 1,88 (1Н, м), 1,7 (1Н, м), 1,66 (3Н, д, J = 7 Гц), 1,6-1,46 (4Н, м), 1,34 (3Н, д, J 6 = Гц), 0,99 (6Н, д, J = 6 Гц), 0,91 (3Н, д, J = 6 Гц), 0,88 (3Н, д, J = 6 Гц), 0,9 (1Н, м).

Таким образом, предложен способ получения производных соединения WS 7622А, обладающего ценными фармакологическими свойствами.

Использование: ингибитор лейкоцитэластазы человека. Сущность изобретения: производные соединения WS7622А общей формулы RO-C₄₇H₆₁N₉O₁₁-OR , где R - метил или ацетил, JC₅₀ 0,0103 мкг/мл. Реагент 1: WS7622А. Реагент 2: триметилсилилдиазометан. Условия реакции: смеси хлороформа и метанола. 1 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ СОЕДИНЕНИЯ WS7622A общей формулы
C₄₇H₆₁N₉O₁₁
где R - метил или ацетил,
отличающийся тем, что проводят реакцию соединения WS7622A с метилирующим или ацилирующим агентом. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью получения диметилпроизводного соединения WS7622A указанной общей формулы, где R - метил, со следующими физико-химическими характеристиками:
внешний вид - белый порошок;
брутто-формула: C₄₉ H₆₇ N₉ O₁₃;
FAB - M S m /Z : 990 (M + H)⁺;
тонкослойная хроматография (ТСХ):
(пластинки с силикагелем, МеркАрт 5715);
хлороформ - метанол (5 : 1 об./об.) R_f 0,72;
хлороформ - метанол (9 : 1 об./об.) R_f 0,40;
удельное вращение /α/_D²³+37^o[c=1,6 CHCl₃-MeOH(1:1)] ;
инфракрасный спектр поглощения (нюджол) ν_max : 3400, 3240, 1730, 1660, 1640, 1540, 1520, 1330, 1260, 1210, 1180, 1160, 1100, 1080, 1000, 980, 920 см^-1;
спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹Н (400 МГц, СД₃ОД) δ : 7,2 - 7,11 (3Н, м), 6,93 (1Н, с), 6,83 (1Н, к, J = 7 Гц), 6,77 (2Н, л, J = 8 Гц), 6,59 (1Н, с), 5,48 (1Н, м), 5,15 (1Н, м), 4,85 (1Н, с), 4,76 (1Н, м), 4,67 (1Н, м), 4,42 (1Н, м), 3,99 - 3,89 (2Н, м), 3,82 (3Н, с), 3,81 (3Н, с), 3,66 (1Н, м), 3,55 (1Н, м), 3,02 (1Н, м), 2,95 (3Н, с), 2,9 (1Н, м), 2,6 - 1,94 (6Н, м), 1,82 (1Н, м), 1,77 (3Н, д, J = 7 Гц), 1,68 - 1,58 (4Н, м), 1,46 (3Н, д, J = 7 Гц), 1,13 (3Н, д, J = 6 Гц), 1,12 (3H, d, J = 6 Гц), 1,01 (3Н, д, J = 6 Гц), 0,96 (3Н, д, J = 6 Гц), 1 (1Н, м),
проводят реакцию соединения WS7622A с метилирующим средством. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью получения диацетилпроизводного соединения WS7622A указанной общей формулы, где R - ацетил, со следующими физико-химическими характеристиками:
внешний вид - белый порошок;
брутто-формула: C₅₁ H₆₇ N₉ O₁₅;
FAB - M S m / Z : 1046 (M + H)⁺;
тонкослойная хроматография: пластинки с силикагелем (Мерк Арт 5715):
хлороформ - метанол (5 : 1 об./об.) R_f 0,73;
хлороформ - метанол (9 : 1 об./об.) R_f 0,40;
удельное вращение /α/_D²³+29^o[c=1,0 , CHCl₃-MeOH(1:1)] ;
инфракрасный спектр поглощения (нюджол) ν_max : 3400, 1770, 1730, 1660, 1640, 1540, 1420, 1340, 1260, 1210, 1080, 1010, 980, 920 см^-1;
спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹Н (400 МГц, ДМСО - d₆) δ : 9,48 (1Н, уширенный сигнал), 8,37 (1Н, д, J = 8 Гц), 7,76 (1Н, д, J = 7 Гц), 7,23 - 7,1 (4Н, м), 7,18 (1Н, с), 7,03 (1Н, д, J = 9 Гц), 6,93 (1Н, с), 6,76 (2Н, д, J = 8 Гц), 6,74 (1Н, уш.с), 6,65 (1Н, к, J = 7 Гц), 5,74 (1Н, м), 5,42 (1Н, м), 5,08 (1Н, с), 4,77 (1Н, д, J = 10 Гц), 4,64 (1Н, м), 4,57 (1Н, м), 4,42 (1Н, м), 3,92 - 3,78 (2Н, м), 3,49 (1Н, м), 3,34 (1Н, м), 2,9 (1Н, дв.д, J = 13 и 12 Гц), 2,8 (3Н, с), 2,7 (1Н, м), 2,6 (1Н, дв. д, J = 13 и 12 Гц), 2,8 (3Н, с), 2,7 (1Н, м), 2,6 (1Н, дв.д, J = 13 - 11 Гц), 2,54 (1Н, септет, J = 6 Гц), 2,42 - 2,27 (3Н, с), 2,27 (3Н, с), 2,25 (3Н, с), 2,17 (1Н, м), 1,88 (1Н, м), 1,7 (1Н, м), 1,66 (3Н, д, J = 7 Гц), 1,6 - 1,46 (4Н, м), 1,34 (3Н, д, J = 6 Гц), 0,99 (6Н, д, J = 6 Гц), 0,91 (3Н, д, J = 6 Гц), 0,88 (3Н, д, J = 6 Гц), 0,9 (1Н, м),
проводят реакцию соединения WS7622A с ацилирующим средством.