Способ получения производных пептидов WS-9326 А Советский патент 1993 года по МПК C07K7/06 C07K7/52 A61K37/02 

Изобретение касается способа получения пептидных производных WS-9326 А, ко- торые обладают фармакологической активностью, такой как антагонизм к веществу Р, антагонизм к нейрокинину А (вещество К), или тому подобным.

Целевые производные пептида WS- 9326 А согл асно изобретению могут быть представлены следующей формулой I

0-й2

ф

нн

ftb-Thr-N-C-C-Uu-D-Phe-ailo-Tbr-Asti-Scfсн.

где Я ь представляет собой ар(низкий)алка- ноил, имеющий С5-алкил в орто-положении и Р2-водород или низкий алканоил.

Согласно изобретению пептидные производные WS-9326A формулы I могут быть получены следующим способом.

Способ. 0-R7

НС О

11 II

R a-Thr-N-C-C-Leu-D-Phe-aUO-Thr-ASrrSer-i сньI

O-R

(Ш

I

ВОССТАНОВЛЕНИЕ

НС ОRR

1и и I

R-Thr-N-C-C-Leu-D-Pbe-aUO-Tht -Asn-Ser

b 1 t

снг

J

00

ю о ю XI о

CJ

(I)

4о

где R б и R имеют значения, указанные выше.

R a означает ар (низкий) алкеноил с С - алкенилом в орто-положении.

Способ получения целевого соединения формулы I пояснен ниже.

Способ.

Соединение I или его соль можно получить, подвергая восстановлению соединение II или его соль.

Подходящими катализаторами, используемыми при каталитическом восстановлении,являютсятрадиционные восстановители, также как платиновые катализаторы (т.е. платиновая пластинка, губчатая платина, платиновая чернь, коллоидная платина, окись платины, платиновая проволока и так далее), палладиевые катализаторы (т.е. губчатый палладий, пал- ладиевая чернь, окись палладий, палладий на угле, коллоидный палладий,палладий на сульфате бария, палладий на карбонате бария и так далее), никелевые кагалмзаторры (т.е. измельченный никель, окись никеля, никель Ренея и так далее), кобальтовые катализаторы (т.е. измельченный кобальт, кобальт Ренея и так далее), железные катализаторы (т.е. измельченная медь, медь Ульмана и так далее) и тому подобные.

Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком как ацето, диок- сан, спирт, гетрагмдрофурам, этилацетат, М,М диметилформамид, диметилсульфок- сид или любой другой растворитель, который не влияет отрицательно на реакцию.

Температура реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до нагревания.

Исходные соединения Н и ill являются новыми и могут быть получены следующими способами.

Исходное соединение II - новое, может быть приготовлено путем следующих процессов синтеза и ферментации.

(Продукт процессов синтеза)

С п о с п б А. 0-V

не оу у

H-T.hr-N-C-C-Leu-D-PVie-auo-Thf-ASn-Ser1- СНЭ

или его реакционное производное при аминофуппе или его соль

0-R

Ф

НС О

АЦИЛИРОВАНИЕ R

o -T -M- -c-Leu-D-Phe-ullO-Thr-Asn Ser а, i

L сн

(10

СпособВ.

НС ОRR

1И 11II

R-Thr-N-C-C-Leu-D-Phe-aUO-Thr-Asn-SeT1- a . i

,о L15

НС, О

С лИМII

R -Thr-N-C-C-Leu-D-Phe-aUo-Thr-ASn-Ser

А 1

снь

J

(ПЬ)

лг

20 где R3 и R имеют значения, указанные выше;

9

R а - низший алканоил.

С п о с о б А.

Соединения II могут быть получены пу25 тем реакции ацилирования соединения 111 или его реакционноспособного производного при аминогруппе или его соли.

Походящее реакционноспособное производное при аминогруппе соединения III

30 может включать основание Шиффа иминно- го типа или его таутомерный изомер анами- нового типа, полученное при реакции соединения III с карбонильным соединением, таким как альдегид, кетон и тому подо35 бное; силильное производное, полученное взаимодействием соединений III с силильным соединением, таким как био-(триметилсилил)- ацетамид, моно-(триметилсилил)-ацетамид, био-(триметилсияил)-мочевина или тому по40 добными; производное, образованное при взаимодействии соединения 111с треххлори- стым фосфором или фосгеном и тому подобными.

Подходящее ацилирующее средство,

45 используемое в настоящей реакции ацилирования, может включать традиционное ацилирующее средство может быть выражено формулой RV-OH (XIV)

50 где R а имеет значение, определенное ранее) или его реакционноспособное производное или его соль.

Подходящее реакционноспособное производное соединения формулы (XIV) мо55 жет включать галоидангидрид, ангидрид кислоты, активированный амид, активированный сложных эфир и тому подобное. Подходящим примером может быть хлоран- гидрид; азид кислоты, смешанный ангидрид кислоты с кислотой, такой как замещенная

фосфорная кислота (т.е. диалкилфосфорная кислота, фенилфосфорная кислота, дифе- нилфосфорная кислота, дибензилфосфор- ная кислота, галогенизированная фосфорная кислота и так далее), диалкил- фосфористзя кислота, сернистая кислота, тиосерная кислота, сульфокислота (т.е. ме- тансульфоксилота и так далее), алкилугле- кислота, алифатическая карбоновая кислота (т.е. пизалиновая кислота, валериановая кислота, изовалериановая кислота, 2-этил- масляная кислота или трихлоруксусная кислота и так далее) или ароматическая карбоновая кислота (т.е. бензойная кислота и так далее); симметрический ангидрид кислоты, активированный амид с имидазолом, 4-замещенный имидазол, диметилпиразол, триезол или тетразол; или активированный сложный эфир (т.е. цианометиловый сложный эфир, метоксиметиловый эфир, димети- лиминометиловый эфир (CHa) пропаргиловый эфир, пэранитрофениловый эфир, 2,4-динитрофениловый эфир, трих- лорфениловый эфир, пентахлорфениловый эфир, метилсульфонилфениловый эфир, фе- нилазофениловый эфир, фениловый тиоэ- фир, п-нитрофениловый тиоэфир п-трезиловый тиоэфир, карбоксиметиловый тиоэфир, пираниловый эфир, пиридиловый эфир, пиперидиловый эфир, 8-хинолило- еый тиоэфир и так далее) или сложный эфир с N-оксисоединением (т.е. N.N-диме- тилгидроксиламин, 1-окси-2(1 Н)-пиридон, М-оксисукцинимид, N-оксифталимид, 1-ок- си-6-хлор-1Н-бензотиазол и так далее) и тому подобны). Эти реакционноспособные производные могут быть необязательно выбраны из них в соответствии с видом используемого соединения формулы (XIV).

Реакцию обычно проводят в традиционном растворителе, таком как спирт (т.е. метанол, этанол и так далее), ацетон, диоксан, ацетонитрил, тетрагидрофуран, N.N-диме- тилформамид, пиридин или любой другой растворитель, который не влияет отрицательно на реакцию. Этот традиционный растворитель может быть также использован в смеси с водой.

Если соединение (XIV) используют в форме свободной кислоты или в форме ее соли в этой реакции, то реакцию предпочтительно проводят в присутствии традиционного конденсирующего средства, такого как М.м -дициклогексилкарбодиимид, М-цикло- гексил-Ы1-морфолиноэтилкарбодиимид, N- циклогексил-N -(4-диэтиламиноциклогексил)- карбодиимид, N,N -диэтилкарбодиимид, N.N -диизопропилкарбодиимид, М-этил-N - (З-диметиламинопропил)-карбодиимид, М,М-карбонилбис-(2-метилимидазол), пентаметиленкетен-М-циклогексиламин, дифе- нилкетен-Ы-циклогексилимин, этоксиацети- лен,1-алкокси-1-хлорэтилен,

триалкилфосфит, этилполифосфат. изопро- 5 лиловый эфир полифосфорной кислоты, ок- сихлорид фосфора (хлористый фосфарин), треххлористый фосфор, хлористый оксал- кил, трифенилфосфин, хлористый тионил. соль 2-этил-7-оксибензилоксазолил, гидро- 0 окись 2-этил-5-(мета-сульфофения)-изокса- золил, внутримолекулярная соль, 1-(п-хлорбензолсульфонилокси)-6-хлор-1Н -бензотриазол, так называемый реактив Вильсмайера. полученный взаимодействи- 5 ем М -диметилформамида с хлористым ти- онилом, фосгеном, трихлорметиловым эфиром хлормуравьиной кислоты, оксихло- ридом фосфора, и подобные.

Реакция может быть также проведена в 0 присутствии неорганического или органического основания, такого как бикарбонат щелочного металла, три(низший)алкиламин, пиридин, М-(низший)алкилморфолин, JM,N- ди{низший)элкилбензиламин. Температура 5 реакции не является критической и реакцию обычно проводят при температурах от охлаждения до комнатной температуры.

Способ В.

Соединение II или его соль могут быть 0 получены путем реакции ацилирования соединения На или его соли.

На эту реакцию имеется ссылка в Получениях 29 31, описанных позднее.

(Получение ферментацией) 5 WS-9326A можно получить ферментацией WS-9326A продуцирующих штамма, принадлежащего к роду Streptomyces, такому как Streptomyces Violaceoniger № 9326 в питательной среде.

0 Специфические микроорганизмы, использованные для получения WS-9326A, будут описаны в дальнейшем.

Микроорганизм.

5 Микроорганизм, который может быть использован для продуцирования WS- 9326А, является штаммом-продуцентом WS-9326A, принадлежащим к роду Streptomyces, из которого Streptomyces

0 violaceoniger W 9326 недавно был выделен из твердого образца, находящегося в коллекции Suwa City, Nagano Prefecture, Japan. Лиофилизированный образец вновь выделенного Streptomyces violaceoniger №

5 9326 депонирован в Научно-исследовательском институте агенства промышленных знаний и технологии (1-3, Higshi l-chome, Tsukuba-shl, Ibarakl-Ken 305, Japan) под номером ЕРМ ВР-1667 (дата депонирования: 20 января 1988г.).

Понятно, что продуцирование новыхпоказывала гигроскопические свойства на

WS-9326A не ограничивается описываемымбольшинстве агаровых сред. Обратная стоздесь конкретным организмом, которыйроня культуры была желтовато-коричневая,

приведен лишь в целях иллюстрации. Этокоричневая и темно-коричневая. Пигмент

изобретение включает также использова-5 мицелия обратной стороны не чувствителен

ние любых мутантов, которые способнык рН среды. Меленоидные пигменты и друпродуцировать WS-9326A, включая природ-гие растворимые пигменты не продуцируют,

ные мутанты, а также искусственные мутан-Анализ клеточных стенок был выполнен

ты, которые могут быть получены отпо методам Беккера и соавторов (Beeker В,

описанного здесь организма традиционны-10 М,Р. Lechevalier, R, E. Gordon and

ми средствами, такими как облучение рент-H.A.Lechevalier. Быстрая дифференциация

геновскими лучами, ультрафиолетовыммежду Nocardio и Streptomyces хроматограизлучением, обработка М-метил-М1-нитро-фией на бумаге цельного клеточного гидроN-нитрозогуанидином, 2-аминопурином илизата. Appl. Microbiol, 12, 421-423, 1964 и

тому подобными, Streptomyces15 Ямагуши Janagucht, Т. Сравнение состава

vtolaceoniger №9326 имеет следующие мор-клеточных мембран морфологически разфологические, культу рал ьные, биологиче-личных актиномицетов. - I. Bacteriol, 89,

ские и физиологические характеристики.444-455, 1965). Анализ цельных клеточных

(1)Морфологические характеристики.гидролизатов штамма № 9326 показал прибыли использованы методы, описанные20 сутствие LL-диаминомимелизовой кислоты,

Ширлингом и Готлибом (Shlrling E. В. andСледовательно, клеточная стенка этого

Gottlieb D). Методы для характеристики ви-штамма, по-видимому, типа 1.

дов Streptomyces. - International Journal of(3) Биологические и физиологические

Sistemate Bacteriology, 16, 313-340, 1966)свойства.

для этого таксономического исследования.25 Физиологические свойства и усвоение

Морфологические наблюдения были вы-источников углерода показаны в табл, 2 и 3

полнены на оптическом и электронном мик-соответственно.

росхемах на культуре, выращенной приИспользование источников углерода опре30°С в течение 14 дней на агаре с дрожже-деляли методами Придхема и Готлиба (Pridham

во-солодовым экстрактом, на агаре из овся-30 Т. G. and Gotlieb. Использование углеродных

ной муки, на агаре из крахмала исоединений некоторыми актиномицетами как

неорганических солей.вспомогательное средство определения видов.

Вегетативный мицелий развит хорошо-I. Bacteriol,,56,107-114, 1948).

без фрагментации. Воздушный мицелийМорфология и химические характериразветвлен моноподиально и образует спи-35 стики штамма № 9326 позволяют четко отнеральныецеписпорс 10-30 спорами на день.сти организм к роду Streptomyces, Штамм №

Споры имеют гладкую поверхность и оваль-9325 сравнивали с видами Streptomyces,

ную форму с размерами (0,6-0,8)х{0,8-1,3)описанными в 8-м издании руководства Бермкм. Отвердевших гранул, спорангия и зоо-гея (Buchanan R. E. and N. E. Gibbons

спор не наблюдали.40 Sergey s manual of determinative

(2)Культуральные характеристикиbacteriology/ ,cighl edition, The Williams and Культуральные характеристики наблю-Wilkins Co, Baltimore, 1974), с видами

дали на десяти видах сред, описанных Шир-Streptomyces, описанными в докладах Ширлингом и Готлибом в упомянутом вышелинга(ЗЫг11пд,Е. В. and D.Gottliebl. Совме- мсточнике и Ваксманом (Waksman S. A.: The45 СТНое описание типичной культуры actinomycetes vol. 2: Classification,Streptomyces. 2. Описания видов по резуль- identiaication and description of genera andтатам первого исследования. Intern, I. Syst. species. The Williams and Wllnins G.,Bacterlol., 18, 69-189, 1968). (Shirlmg E. B. Baltimore, 1961). and D, Gottlieb: 1.Совместное описание тиВыращивание проводили при 30 С в те-50 пичной культуры Streptomyces). 2. Описания

чение 21 дня. Названия цвета, использован-видов по результатам первого исследованые в этом исследовании, взяты изНИЙ1 intern, I. Syst. Bacteriol. 18; 69-189,

колориметрического руководства Метуэна1968). (Shirting Е.В. and D.Gottlteb: Совмест(Kornerup A. and I. H. Wanscher: MethuenHoe описание типичной культуры

Handboon of colour, methuen, London, 1978).55 Streptomyces). 3. Дополнительные описания

Результаты представлены в табл. 1. видов по результатам первого и второго исследований. Intern. I. Syst. Bacteriol. 18: 279Воздушный мицелий имел окраску от392, 1968 и (Shirlmg E. В. and D. Gottlieb:

серого до коричневато-серого цвета. ЧастьСовместное описание типичной культуры

колонии становилась черной и влажной и„Sjreptomyces).

4. Описания видов по результатам второго, третьего и четвертого исследований Intern. I. Syjjt. Bacteriol. 19: 391-512, 1969, с видами, внесенными в Уточненные перечни названий бактерий: (Skerman, V. В. D; V. MeGowan 8 Р.Н.А. Sneath: Уточненный список бактериальных названий. Intern. I. Syst. Bacteriol: 30: 225-420, 180), и с видами, описанными в других источниках (Williams S. Т., М. Goodfellow, G. Alderson, Е. М. Н. Wellington, P. H. A. Sneath and М. I, Sackin: Численная классификация Streptomyces и родственных родов. I. Gen. Microbiol. 129: 1743-1813, 1983) и /Dietz, А: Критерии для характеристики гигроскопических штаммов, опубликованы в Actinomycetes; The Boundary Microorganisms с. 183-191, изданный в 1976).

В результата сравнений было установлено, что штамм № 9326 имеет близкое сходство со Streptomyces violaceoniger. Поэтому штамм Nfe 9326 был идентифицирован как Streptomyces violaceoniger и назван Streptomyces violaceoniger № 9326.

Получение WS-9326A.

Новые WS-9326A согласно изобретению могут быть получены выращиванием штамма-продуцента WS-9326A, принадлежащего к роду Streptomyces (т.е. Streptomyces violactoniger Ms 9326, ЕРМ ВР-1667) в питательной среде.

В общем WS-9326A могут быть получены выращиванием штамма-продуцента WS- 9326А в водной питательной среде, содержащей источник усвояемого углерода и азота, предпочтительно в аэробных условиях (т.е. встряхиваемая культура, погруженная культура и так далее).

Предпочтительными источниками углерода в питательной среде являются углеводы, такие как глюкоза, ксилоза, галактоза, глипе- рин, крахмал, декстрин и тому подобные.

Другими источниками, которые могут быть использованы являются мальтоза, рам- ноза, рафиноза, арабиноза, манноза, сели- цин, сукцинат натрия и тому подобные.

Предпочтительными источниками азота являются дрожжевой экстракт, пептон, клейковина, хлопковая мука, соевая мука, экстракт от замачивания кукурузы, пшеничные проростки, высушенные дрожжи, молотое перо, порошок земляного ореха и так далее, а также неорганические и органические соединения азота, такие как соли аммония (т.е. нитрат аммония, сульфат аммония, фосфат аммония итак далее), мочевина, аминокислоты и тому подобные.

Источники углерода и азота, хотя и преимущественно используемые в сочетании, не обязательно используются в чистой форме, поскольку менее чистые материалы, которые содержат следы ростовых факторов и значительные количества минеральных питательных веществ, также пригодны для использования. Они могут быть добавлены к 5 минеральным солям среды, таким как карбонат натрия или кальция, фосфат натрия или калия, хлористый натрий или калий, йодистый натрий или калий, соли магния, соли меди, соли кобальта и тому подобные. Если

необходимо, особенно когда культуральная среда сильно вспенивается, могут быть добавлены антивспениватели, такие как жидкий парафин, жировое масло, растительное масло, минеральное масло или силикон.

5Как условия для получения WS-9326A в

больших количествах предпочтительны аэробные условия погруженной культуры. Для получения небольших количеств используют встряхиваемые или поверхностные

0 культуры в колбах или бутылях. Кроме того, если выращивание проводят в больших резервуарах, то предпочтительно использование вегетативной формы организма для инокулирования в ферментационные емко5 сти, чтобы избежать латентный период развития культуры в процессе получения WS-9326A. Таким образом, желательно сначала получить посевную культуру организма инокулированием относительно малого коли0 чества культуральной среды спорами или мицеллами микроорганизма и выращиванием этой инокулированной среды и затем перенести выращенный вегетативный инокулят в асептических условиях в большие резервуары.

5 Среда, в которой получен вегетативный инокулят, аналогична или отличается от среды, используемой для получения WS-9326A.

Перемещение и аэрация культуральной смеси могут быть осуществлены различными

0 путями. Перемешивание может быть проведено лопастями винта или аналогичными механическими мешалками, вращением или встряхиванием бродильного чана, различны- . ми нагнетающими устройствами или пропу5 еканием стерильного воздуха через среду. Аэрация может быть осуществлена путем пропускания стерильного воздуха через ферментационную среду.

Брожение обычно проводят при темпе0 ратуре от 20 до 40°С, предпочтительно при 25-35°С, в течение времени примерно от 50 о 150 ч, которые могут варьировать в соответствии с условиями брожения и масштабами производства.

5Полученные WS-9326A могут быть затем

выделены из культуральной среды традиционными средствами, которые обычно используются для выделения других известных биологически активных веществ. Полученные WS-9326A были найдены в культуральном фильтрате и мицелии, таким образом WS 9326A могут быть выделены и очищены из фильтрата и мицелия, которые получены при фильтрации или центрифугировании культуральной жидкости традиционным методом, таким как концентрирование при пониженном давлении, лиофилизация, экстракция традиционным растворителем, регулирование рН, обработка обычной смолой (т.е. анионо- или катионообменная смола, неионогенная абсорбирующая смола итак далее), обработка традиционным абсорбентом (т.е. активированным углем, кремниевой кислотой, силикагельцеллюлозой, глиноземом и тому подобными), кристаллизация, перекристаллизация и тому подобные.

WS-9326A, полученный описанным выше способом, обладает следующими физическими и химическими свойствами.

(1)форма и цвет: бесцветный порошок

(2)цветная реакция:

положительная: на сульфат церия, реакция на пары иода, реакция на хлористое железо (3) - железо (3) цианистый калий; отрицательная: реакция на анигидрин, реакция Молима, реакция на хлористое железо (3), реакция Эрлиха, реакция Паули.

(3)растворимость:

растворим: метанол, этанол, слабо растворим: ацетон, этилацетат нерастворим: вода, хлороформ

(4)точка плавления: 187-190°С

(5)удельное вращение: а$ 3:-84° (,0, метанол)

(6)спектр ультрафиолетового поглощения (метанол): Амакс 280 пикометров ( ,700)

(7)спектр поглощения инфракрасного излучения (КВг): Умакс 3300, 3050, 2950, 2920, 2860, 1730,1650,1610,1560,1540,1530, 1510,1440, 1380,1340, 1280,1240,1170,1110, 1080, 1060, 1040, 970, 880, 860, 830 , график которого представлен на фиг, 1.

(8)элементный анализ для C54H68NaOi3-2H20:

Вычислено %: С 60,43; Н 6,76; N 10,44. Найдено %: С 60,18; Н 6,61; N 10,32.

(9)тонкослойная хроматография

(10)молекулярная формула: Cr HGsNeOi.i

(11)молекулярный вес: АВ-масс-спектр m/z 1037(М+Н)+

(12)свойства вещества: кислое вещество (13) спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 130: (100 МГц, СДзОД) д:

175,69 (с), 174,70 (с), 173,73 (с), 173,38 (с), 172,89 (с), 171,04 (с), 170,45 (с), 167,79 (с), 167,15 (с), 159,20 (с), 140,05 (д), 139,12 (с),

138,71 (с), 135,27 (д), 134,85 (с), 132,11 (д), 132,08 (с), 131,69 (д)х2, 130,70 (д), 129,90 (д), 130,70 (д), 129,90 (д), 129,61 (д)х2, 128,55 (д), 128,04 (д), 127,99 (д), 127,38 (д), 126,09 (с), 123,70 (д), 115,63 (д), 73,46(д), 71,34 (д), 62,80

(т), 59,53 (д), 56.91 (д), 56,76 (д), 55,55(д), 53,64 (д), 52,10(д), 39,85 (т), 37,18 (т), 37,09 (т), 34,58 (кв), 31,37 (т). 24,56 (д), 23,63 (т), 22,71 (кв), 22,52 (кв), 21,17 (кв), 17,19 (кв), 14,13 (кв), график которого представлен на фиг.

2.

(14)спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 1Н, (400 МГц, СДзОД) д:

7,80 (1Н, д, Гц), 7,67 (1Н, д, Мб Гц): 7.45-7,14 (9Н, м), 7,06 (2Н, д, Гц), (1Н. с),

6,65 (2Н, д, Гц), 6,59 (1Н, д, Гц), 5,88 (1Н, дт, 1-12 и 7 Гц), 5.55 (1Н, м, 5,35) (1Н, широкий сигнал), 5,10 (1Н, дд, и 9,5 Гц), 4,68 (1Н, д, Гц), 4,55 (1 Н, т, Гц), 4,48 (1 Г, дд, и 12 Гц). 3,92 (3,92 (2Н, д, Гц),

3,70 (1 Н, т, Н7,5 Гц), 3,62 (1 Н, м), 3,46 (1 Н, дд, и 14 Гц), 2,94 (1Н, дд, ИЗ и 16 Гц), 2,89 (ЗН, с), 2,74 (1Н, дд, ,5 и 16 Гц), 2,69 (1Н, дд, и 14 Гц), 2,14 (2Н, м), 1,5-1,4 (2Н, м), 1,20(ЗН, д, N6 Гц), 1,08(ЗН, д, Гц), 1,0-0,8

(2Н, м), 0,91 (ЗН, т, Гц), 0,6 (1Н, м), 0,53 (ЗН, д, N6 Гц). 0,51 (ЗН, д, Гц), график которого представлен на фиг. 3.

(15)аминокислотный анализ: Л/5-9326(5мг)гидролизовали при 110°С

в течение 20 ч с хлористоводородной кислотой (2 мл) в запаянной пробирке. Смесь выпаривали досуха и получали продукты гидролиза, которые затем анализировали на автоматическом анализаторе аминокислот

Хитами 835.

Результаты аминокислотного анализа:

треонин (2), лейцин (1), фенилаланин (1), аспарагиновая кислота (1), серии (1), металимин (1) и аммиак (1).

Что касается WS-9326A, то следует заметить, что спектры ядерного магнитного резонанса на ядрах 13С и 1Н, представлен- ные на фиг. 2 и 3, показали, что WS-9326A существует по меньшей мере в двух стабильных конформациях в растворе СДзОД, и химические сдвиги, описанные в приведенных выше пунктах (13) и (14), является сдвигами основного конформера WS-9326A.

Из анализа представленных выше физических и химических свойств и по результатам дальнейших исследований по идентификации химической структуры химическое строение WS-9326A идентифици- ровано и интерпретировано следующим образом:

WS-9326A:

R-Thr-N-C-c-Leu-D-Phe-aUo-Thr-ASti-Ser-, | Нер

R-;

н

.CHoCHaCrii

с/ 2 2 3

н

н

/(Е)-3-{2-(2)-1-пентенил)-фенил -пропен- оил/

В изложенном и последующем описании настоящей заявки подходящие примеры и иллюстрации различных определений, которые изобретение включает в свой обь- ем, поясняются детально следующим образом.

Термин низший означает 1-6 углеродных атомов, если не оговорено особо.

Подходящий пример низшего алкэнои- ла включает формил, ацетил, пропаноил, бу- таноил, 2-метилпропаноил; пентаноил. 2,2-диметилпропаноил, гексаноил и т.п.

Подходящий ар(низший)алканоил может включать фенилпропаноил, фенилбута- ноил, фенилизобутилил, фенилпентаноил, фенил гексаноил и так далее), нафтил(ни- зший)алканоил (т.е. нафтилпропаноил, наф- тилбутаноил, нафтилпентаноил и тому подобные).

Подходящий ар(низший)алкеноил может включать: фенил(низший)алкеноил (т.е. фенилпропаноил, фенилбутаноил, фенилме- такрилоил, фенилпентеноил, фенилгексено- ил и так далее), нафтил (низший)алкеноил (т.е. нзфтилпропеноил, нафтилбутеноил, нафтилпентеноил и так далее) и тому подобные.

Подходящий Cs алкил может включать пентил и т.п.

Подходящий Cs алкенил может включить 1-. или 2-. или 3-, или 4-пентенил и т.п.

Биологические свойства пептидных производных WS-9326A.

5

10

0

5

0

5

0 5

0

5

Пептидные производные WS-9326A формулы I и их фармацевтически приемлемые соли обладают фармакологической активностью, такой как антагонизм к веществу Р, антагонизм к нейрокинину А (веществу К), или тому подобными, поэтому они полезны для профилактики и лечения астмы и тому подобного.

В качестве примера демонстрации такой фармакологической активности приводятся ниже данные фармакологических исследований.

1 Испытуемые соединения:

(а) D-PrO-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-D- Trp-Phe-NH2 HCI (ниже называемое октапеп- тидом)

{Указанное соединение раскрыто в European Journal of Pharnacology, 99 (1984) 193-202.

(1)Тетрагидро- Л/5-9326А

(2)Тетрагидротриацетил- Л/5-9326А 11 Методы испытания и результаты: (1) Анализ по степени связывания с радиоактивно меченным лигандом.

(а) Изготовление сырой мембраны.

Легкое.

Самцов морских свинок (альбиносов штамма Хартли, 600 г) умерщвляли путем обезглавливания. Затем удаляли трахеи и легкие и хранили их при -80°С вплоть до использования. Перед использованием указанные ткани оттаивали и гомогенизировали в 500 мл буфера (0,25 М сахарозы. 50 мМ трис-HCI, рН 7.5; 0,1 мМ ЭДТК) с помощью компактного смесителя (MatsudenMI-761). Затем ткань гомогенизировали с помощью ультрадиспергатора (Yarrtato Model LK-21) с интервалами охлаждения между гомогенизациями, составляющими 10 с (полное время гомогенизации составляло 60с). После этого гомогенат центрифугировали (ЭООхд за 10 мин} в целях удаления сгустков ткани, а над- осадочную жидкость центрифугировали при 14000хд 20 мин, в результате чего получали осадки центрифугирования, так называемые неочищенные мембранные фракции. Эти осадки ресуспендировали в Среде 1, гомогенизированной с помощью тефлонового гомогенизатора, и центрифугировали при 14000хд в течение 20 мин. Полученные осадки хранили при температуре -20°С.

(в) Связывание ЗН-вещества Р с подготовленными мембранами.

3Н-вещество (1 нМ, NeW England Nuclear) инкубировали с 50 мкл мембранного препарата в Среде 1 при 4°С в течение 30 мин в конечном объеме 250 мкл. По окончании периода инкубирования смесь быстро титровали через ватман CF/B стекловоло- конный фильтр (предварительно обработанныи 0.1 %-ным полиэтиленимином в течение 3 ч до его применения), используя сбор клеток (Brandel M-24S), Затем фильтры промывали 10 раз 3 мл промывочного буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,5) при 0°С. Радиоактивность рассчитывали вЗ мл Аквозола-2 всцин- тилляционном счетчике (РаскагЬ TRl-CARB 4530).

(2) Действие WS-9326A или тетрагидро- WS-9326A на трахею морских свинок.

Спиральные полоски трахеи получали от взрослых самцов белых морских свинок линии Хартлен (600 г) стандартным методом и помещали в заключенную в футляр 30 мл стеклянную тканевую ванну. Растяжение трахеальных полос измеряли изометрически посредством преобразования усилия сдвига, соединенного с полиграфом (био- псиограф - 180 система San-Ei Instrument). Трахеальные полосы (2 мм шириной и 50 мм длиной) суспендировали при остаточном растягивающем напряжении 500 мг в 30 мл банях, содержащих теплый (37°С) насыщенной кислородом (95% кислорода; 5% углекислого газа) раствор Тирода следующего состава: NaCI 137 ммолей (8 г/л) НС) 2,7 ммоля (0,2 г/л) CaCl2 2H20 t,8 ммоля (0,264 г/л), Mg CI2-6H20 1,02 ммоля (0,208 г/л), ЫзНСОз 11,9 ммоля (2 г/л), NaH2H2PC 4 2H20 0,42 ммоля (0,066 г/л) и глюкозы 5,5 ммоля (1 г/л). Ткани приводили в состояние равновесия в течение 90 мин и затем испытывали WS-9326A против различных бронхоконст- рикторов (вещество Р М). Растяжение регистрировали записывающим устройством San-Ei Rectigraph-8 S, San-El Instrument).

Действие испытуемого соединения на сократительные реакции трахеи морских свинок, вызванные вещества Р приведено в табл. 5.

(3) действие тетрагидро- Л/5-9326А на сужение бронхов, вызванное нейрохинином А.

Самцов морских свинок линии Хартлей, весивших 300-500 г,, обездвиживали пенто- барбиталом натрия (10 мг/животное, вводимым внутрибрюшинно). Брюшную вену канилировали для введения нейрокинина А и лекарства. Катетер был также интубирован в трахею для искусственной вентиляции легких. Животное получало вдыхаемый воздух посредством миниатюрного дыхательного насоса (Harvard B-34, производительность 5 мл/толчок, 60 толчков в 1 мин). Устойчивость к раздуванию легких измерили модифицированным методом обильного излияния Кон- центта-Ресслера.

Агонист вводили внутривенно и антагонистическое лекарство вводили, как показано на фиг. 10 (приготовлено в смеси 0,1%метил-целлюлозы и физиологического раствора):

Ингибирование вызванного нейрокини- ном А сужения бронхов с помощью тетрагидро- А/5-9326А видно из приведенного в табл. 6,

(4) Влияние внутритрахеального введения тетрагидро- Л/59326А на индуцированное нейрокинином А сужение бронхов у

морских свинок.

Для испытания действия ингаляции тет- рагидро- Л/3-9326А на сужение бронхов тет- рагидро- Л/5-9326А растворили в диметилсульфоксиде и вводили внутритрахеально. Метод почти не отличался от описанного выше.

Как показано в табл. 7, тетрагидро-WS- 9326А оказался сильнодействующим средством.

Фармацевнтическая композиция согласно изобретению может быть использована в форме фармацевтического препарата, например в твердой, полутвердой или жидкой форме, которая содержит

пептидные производные формулы I в качестве активного ингредиента в смеси с органическими или неорганическим носителем или наполнителем, пригодным для внешнего, внутривенного или парэнтерального применения. Активный ингредиент может быть смешан, например, с обычным нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем (ями) или изготовления таблеток, гранул, капсул, раствором, эмульсий, суспензий и

других форм, пригодных для использования. Носители, которые могут быть использованы, включают воду, глюкозу, лактозу, аравийскую камедь, желатин, маннит, крахмальную пасту, трисиликат магния,

тальк, кукурузный крахмал, кератин, коллоидную двуокись кремния, картофельный крахмал, мочевину и другие носители, пригодные для использования при производстве препаратов в твердом, полутвердом или

жидком состоянии, и в дополнение могут бьггь использованы вспомогательные средства, стабилизаторы, осушители, красители и ароматические средства. Активное целевое соединение включают в фармацевтическую композицию в количестве, достаточном для получения желаемого действия в зависимости от течения процесса и условий заболеваний.

Поскольку дозирование терапевтически

эффективного количества пептидных производных формулы I варьируется в зависимости от возраста и состояния каждого отдельного больного, подлежащего лечению, то в общем вводят для лечения болезни

дневную дозу 0,01-1000 мг, предпочтительно 0,1-500 мг, наиболее предпочтительно 0,5-100 мг активного ингредиента и однократную дозу примерно 0,5 мг, 1 мг, 5 мг, 10 мг, 50 мг, 100 мг, 250 мг и 500 мг.

В этом описании аминокислоты, пептиды, защитные группы и так далее указаны сокращениями, принятыми IUPFC-1UB (комиссией по биологической номенклатуре), которые являются обычными в данной области.

Кроме того, в последующих примерах и получениях использованы и другие сокращения в дополнение к сокращениям, приня- тым Комиссией по биологической номенклатуре.

Следующие сокращения использованы в настоящем описании:

Thr-L-треонин

Sev-L- серии

Nye-L- тирозин

asn-L- аспэрагин

tlo-The-L-аллотреонин-Phe-D-фенилаланинLeu-L-лейцин

п-Нех-н-гексан Et-этил

z-бензилоксикарбонил

Рас- фенацил Bzl- бензил

Вос- трет-бутоксикарбонилМе-метил

ТС1-2,2,2-трихлорэтилMrup-4-метоксиметоксифенилЗ -трет-бутилметилси

лил ас-ацетил

Следующие примеры и получения даны для иллюстрации изобретения в деталях.

Получение 1.

К раствору гидроокиси калия (26,8 г) в этаноле (500 мл) добавляли глицин (14,6 г) и 4-метоксиметоксибензальдегид (48,5 г) при комнатной температуре. После перемешивания при комнатной температуре в течение 19 ч растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в воде и подкисляли хлористоводородной кислотой. Раствор промывали этилацетатом и устанавливали рН 6,0 бикарбонатом натрия. В осадок выпадало белое твердое вещество, которое со- бирали и получали С-метоксиметил- /2-окситирозин (9,2 г), точка плавления 164- 166°С,

МК-спектр(Квг)-1610см 1.

Получение 2.

К раствору 0-метоксиметил- / оксити- розина(21,0 г) в 1 н. гидроокиси натрия (250 мл) добавляли диметилсульфат (16,5 г). После перемешивания в течение 20 мин при 90°С раствор подкисляли разбавленной хлористоводородной кислотой на ледяной бане. Кислый раствор промывали диэтиловым эфиром и устанавливали рН 6,0 1 н. гидроокисью натрия. После выпаривания твердое вещество собирали фильтрацией и получали 5 О-метоксиметил-Ы-метил-Д- -окситирозин (5,2 г), точка плавления 59-60°С.

ИК-спектр (КВг): 3400, 1700 .

Получение 3.

К раствору О-метоксиметил-М-метил-Д- 0 -окситировина (1501 г) и био-(триметилси- лил)-ацетамида (25 мл) в дихлорметана (150 мл)добавляли раствор 2-нитрофенилсульфо- нилхлорида (11,2 г) в дихлорметане (50 мл). После перемешивания в течение 2 ч при 0°С 5 к раствору добавляли био-(триметилсилил)- ацетамид (10 мл) и хлористый 2-нитрофенил- сульфонил (5,6 г). Смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре и добавляли 1 н. гидроокись натрия (200 мл). Органический 0 слой промывали водой (300 мл) и водные растворы объединяли. После подкисления водного раствора разбавленной хлористоводородной кислотой продукт экстрагировали этилацетатом (300 мл) и экстракт промывали 5 водой (по 100 мл три раза). После просушивания раствора над сульфатом магния растворитель удаляли в вакууме и получали 0-метоксиметил-Ы-метил-М-{2-нитрофенилтио}- / --окситирозин (20,5 г), точка плавления 59- 0 60°С. МК-спектр (КВг): 3400, 1700 см 1.

Получение 4

К раствору 0-метоксиметил-М-метил-М- (2-нитрофенилтио)-окситирозина (20,0 г) в этилацетате (100 мл) добавляли диазометан 5 в диэтиловом эфире (80 мл). После перемешивания в течение 10 мин растворитель удаляли в вакууме. Остаток вводили в колонку силикагеля (Merck 7734, 500 г) и элюировали хлороформом. Получали метиловый эфир 0- 0 метоксиметил-М-(2-нитрофенилтио}-/ -окси- тирозина (трео-изомер: 8,82 г) (зритро-изомер: 6,63 г).

Трео-пармер:

ИК-спектр (пленка): 3500, 2950. 1735 5 Тонкослойная хроматография: ,31 (Merck art 5715. смесь этилацетат-н-гексан в отношении 1:1).

Эритро-параметр:

ИК-спектр (пленка): 3500, 2550, 1735 . 0 Тонкослойная хроматография: ,40 (Merck art 5715. этилацетат-н-гексан в отношении 1:1).

Получение 5.

К раствору метилового эфира 0-меток- 5 симетил-М-метил-М-(2-нитрофенилтио)- fi- окситирозина (эритро-изомер) (3,85 г) в дихлорметане (30 мл) добавляли триэтиле- мин (1,38 г), 4-диметиламинопропилемин (0,45 г) и хлористый бензоил (1,52 г). После перемешивания в течение 16 ч при комнат19 182697020

ной температуре к смеси добавляли 3-диме-К раствору М-бензилоксикарбонил- тилэминопропиламин (3,3 г) и растворительтреонина (3,7 г) и метилового эфира 0-метокудаляли в вакууме. Остаток растворяли всиметил-М-метил- /2-бензоилокситирозинэ

этилэцетате(30 мл) и промывали разбавлен-(трео-изомер)(3,11 г) в дихлорметане (50 мл)

ной хлористоводородной кислотой, водным5 добавляли этиловый эфир 1.2 -дигидро-2раствором бикарбоната натрия и водой, По-этокси-1-кинолиакарбоновой кислоты (2,9 г),

еле выпаривания остаток помещали в колон-После перемешивания в течение 20 мин при

ку силикагеля (Merck 7734, 150 г) икомнатной температуре растворитель удаэлюировали смесью н-гексан-этилацетат вляли в вакууме. Остаток растворяли в этилаотношении 5:2 по объему и получали мети-ю цетате (50 мл) и промывали

ловый эфир 0-метосиметил- М-метил-М-(2-дистиллированной хлористоводородной

нитрофенилтио)-/М5ензоилокситирозинакислотой, водным раствором бикарбоната

(эритро-изомер, 4,49 г).натрия и водой. После выпаривания остаток

ИК-спектр (пленка): 2950, 1974 см ,вводили в колонку силикагеля (Merck 7734,

Тонкослойная хроматография: ,2315 100 г) и элюировали смесью н-гексан-этила(Merck art 5715, смесь этилацетал-н-гексан вцетат в отношении 1:1 по объему и получали

отношении 1:2).метиловый эфир М-(М-бензилоксикарбоПолучение 6. нил- -треонил)-0-метоксиметил-М-метил-/ Следующее соединение было полученобензоилокситирозина (трео-изомер)(2,04 г).

способом, аналогичным описанному в пол-20 МК-спектр(пленка):3400,2950, 1740(изучении 5:гиб пика), 1720 см.1

метиловый эфир О-метоксиметил-М-метил-Тонкослойная хроматография: ,36

М-{2-нитрофенилтио)т 3-бензоилокситирозина(Merck art 5715, смесь метанол-хлороформ в

(трео-изомер),отношении 3:97).

точка плавления 114-111°С.25 Получение 10

ИК-спектр (СНС1з): 2950, 1740см 1.Следующее соединение получали споТонкослойная хроматография: ,26собом, аналогичным описанному в получе(Merck art 5715, смесь этилацетат-н-гексан внии 9:

отношении 1:2).метиловый эфир М-(М-бензилоксикарбоПолучение 730 нил-1 -треонил)-0-метоксиметил-Н-метил-/ К раствору метилового эфира 0-меток-бензоилокситирозина (эритро-изомер).

симетил-М-метил-М-(2-нитрофенилтио)- /3-МК-спектр (пленка): 2950,1740,1730(избензоилокситирозина (4,94 г) вгибпика)см.

дихлорметане (50 мл) добавляли тиофенолТонкослойная хроматография: ,23

(4,8 мл) и трифторуксусную кислоту при 0°С35 (Merck art 5715, смесь этилацетат-н-гексан в

(2,5 мл). После перемешивания в течение 30отношении 1:2).

мин к смеси добавляли водный раствор би-Получение 11.

карбоната натрия. Органический слой про-Mwp

мывали водным раствором бикарбонатаг п

натрия и рассолом. После выпаривания ос-40 МИ (целевое

таток помещали на колонку с силикагелемZ-Thf -N-С-С ОМб соединение 1)

(Merck 7734) (100 г) и элюировали 5%-ным1

метанолом в хлороформе. Получали метило-

вый эфир 0-метоксиметил-М-метил-Д- -бен-К раствору метилового эфира Д-бензозоилокситирозина (трео-изомер 0,32 г).45 илокси-г-НМ-бензилоксикарбонил-1 -треон

ил)-0-метоксиметил-М-метилтирозина (треоТонкослойная хроматография: ,31изомер) (1,20 г) в толуоле (20 мл) добавляли

(Merck art 5714, смесь этилацетат-н-гексан в1,8-диазабицикле (5.4.0)-ундецен-7-ен (0,30

отношении 1:1).г), После перемешивания в течение получаса

Получение 850 при комнатной температуре к смеси добавСледующее соединение получали спо-ляли 7%-ную хлористоводородную кислоту

собом, аналогичным описанному в получе-(10 мл). Органический слой промывали вонии 7:дои и водным раствором бикарбоната наметиловый эфир 0-метоксиметил-М-ме-трия. После сушки органического слоя над

тип-/ - -бензоилокситирозина (эритро-изо-55 сульфатом магния растворитель удаляли в

мер). вакууме и получали целевое соединение I

Тонкослойная хроматография ,25(0,95 г),

(Merck art 5715, смесь этилацетат-н-гексан вМК-спектр (пленка): 3400, 2930,1720см 1,

отношении 1:1).ra$. 7Jo () метанол).

Получение 9

Целевое соединение I было также получено взаимодействием метилового эфира бензоилокси-М-(М-бензилоксикарбонил-1.- треонил)-0-метоксиметил-М-метилтирозина (эритро-изомер) вместо метилового эфира ft - бензоилокси-М-(М-бензилоксикарбонил-1 - треонил)-О-метоксиметил-М-метилтмрозина (трео-изомер).

Получение 12 Мг

исходное соединение а

imp H ч /

с о

Z-Thr-N-C-C-OMe

Me

Mmp H Sif Y 0 z-|hr-N-C-C-OMe Челевое соединение Me

К раствору исходного соединения а (1,0 г) в М,Г -диметилформамиде(10 мл) добавляли трет-бутилдиметиллилхлорид {0,75 г) и имидазол (0,34 г). После перемешивания в течение 16 ч при комнатной температуре к смеси добавляли этилацетат (30 мл) и лед (50 г). Органический слой промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, водным раствором бикарбоната натрия и водой. Растворитель удаляли в вакууме. Остаток вводили в колонку силикагеля (Merck 7734, 30 г), элюировали хлороформом и получали целевое соединение I (1,21 г).

ИК-спектр (пленка): 2950, 1720 см

-55,9° (,56, метанол).

Получение 13 ..

Mmp Н .

Si+ C Оа

Ч IIи

Z-Thr-N-C- С-ОМе

Me

-1

М

н

I

Si С О III и

Z-Thr-N-C-C-OH

Me

исходное соединение а

целевое соединение I

К раствору исходного соединения а (0,95 г) добавляли 1.н. водный раствор гидроокиси натрия (4,8 мл). После перемешивания в течение двух дней при 30°С растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате (20 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой. После выпаривания получали целевое соединение I (0,81 г).

МК-смектр (пленка): 3300, 2950. 1720, 1700 (изгиб пика) см 1,

а : -82,9° (,0б. метанол), Получение 14

Мщр Н

s;+ Yo

I II II

Z-Thf-N-c- С-Он t- HCI-H-Leu-D-Phe-OTce Me

0 исходное соединение а исходное соединение b Mmp H

Si

N /

С О

5 И И

- Z-Thf-N-C-C-Leu-D-Phe-OTce

Me

целевое соединение I

20 к смеси исходного соединения а (1,60 г) и исходного соединения b (5,50 г) в дихлор- метане (50 мл) добавляли триэтиламин )1,25 г) и этиловый эфир 1,2-дигидро-2-этокси-1- хинолинкарбоновой кислоты (3,04 г). После

25 перемешивания в течение 15 ч при комнатной температуре белое твердое вещество отфильтровывали и к фильтрату добавляли исходное соединение b (2,23 г), триэтиламин (0,50 г) и этиловый эфир 1,2-дигидро-2-эток30 си-1-хинолинкарбоновой кислоты (1,24 г). Смесь перемешивали 18 ч и растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате (50 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, водным рас35 твором бикарбоната натрия и водой. После выпаривания в вакууме остаток помещали в колонку силикагеля (Merck 7734, 100 г), элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 2:7 по объему и получали целевое

40 соединение I (0,87 г).

ИК-спектр (пленка): 2950, 1760, 1740 (изгиб пика), 1720, 1660см 1.

-31,5° (.07. метанол). Получение 15

45

MmpN H Si СО Z-Thr-N-C-C-Leu-D-Phe-OTce

меJ

исходное соединение а

Н Mmp с.+ V л StСО

(1 II

Z-Thr-N-C-C-Zeu-D-Phe-OTce

Me

целевое соединение I

Раствор исходного соединения а (0,85 г) в толуоле (100 мл) и ацетоне (10 мл) облучали ультрафиолетовой лампой (100 В) в течение 1,5 ч при 0°С, После выпаривания остаток помещали в колонку силикагеля (Merck 77340, 50 г), элюировали смесью н-гексан- этилацетат в отношении 2:1 по объему и получали целевое соединение 1(0,18 г).

Тонкослойная хроматография: Rf 0,22 (Merck art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в отношении 2:1).

М К-спектр (KB г): 3300, 1740 (изгиб пика), 1640см 1.

Получение 16

Ммр Н

si+ со

IИ

Z-Thv-N-C-C-Leu-D-Phe-OTce

ме|

исходное соединение а Н MmpI

+ V О

Si

7 TU к, Д

Z-Thr -N C-C-2eu-0-phe-OTce Me

целевое соединение {

Исходное соединение а (0,17 г) растворяли в 67%-ном водном растворе уксусной кислоты (10 мл). После перемешивания в течение 28 ч при 25°С растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в этилацетате (20 мл) и промывали водным раствором бикарбоната натрия и водой. После концентрирования остаток промывали н-гексаном и растворитель удаляли в вакууме. Получали целевое соедлинение f (0,15 г).

МК-спектр (КВг): 3250. t740 (изгиба пика), 1635см 1.

Тонкослойная хроматография; Rf 0,18 (Merck art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в отношении 1:1).

Получение 17

н

С О8. t

II И+1

Z-Ttir-N-C-C-Leu-D-Phe-OTc6 Boo Ser

Meai

исходное соединение а исходное сое- Bztдинение b

Boc-Set н xMmp SC 0

„ ,.. I

Z Thr N-C-c-teu-D-Phe-OTCe,

Me целевое соединение I

К раствору исходного соединения а (0,14 г) в дихлорметане (5 мл) добавляли исходное соединение b (0,10 г), водорастворимый гидрохлорид карбодиимида (65 мг) и 4- диметиламинопиридина (4 мг). Затем после 12-часового перемешивания при комнатной температуре к смеси добавляли Ы,Г4-диме- тиламинопропиламин (50 мг) и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток растворяли

в этилацетате (20 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой. После выпаривания остаток вводили в колонку силикагеля (Merck 7734, 10 г), элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 1:1 по объему и получали целевое соединение I (0,16 г).

МК-спектр (КВг): 3300, 1700, 1640, 1495

см

1

Тонкослойная хроматография: ,38 20 (Merck art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в отношении 1:1). Получение 18

Н ,Мтр

Bzl

oc Boc-Ser-i V 0 25-7 Ji «

z -Thr-N- c- C-Leu-D-Phe-OTce

Me

исходное соединение а

Bzl Boc-Asn-SerH

//

-|CO

Z-Thr-N-|i Leu 0 pbe oTce

Me

целевое соединение f Исходное соединение а (145 мг) растворяли в смеси 4 н. хлористого водорода в

диоксане (3 мл) и анизоле (0,1 мл). После 30-минутного перемешивания при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в дихлорметане (3 мл). К раствору добавляли N-трет-бутоксикарбонил-Ьаспарагин (35 мг), триэтиламин (13 мг), 1-оксибензотриазол (18 мг) и растворимый в воде гидрохлорид карбодиимида (29 мг). После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавляли 7%-ную хлористоводородную кислоту (5 мл). Органический слой промывали водой. После выпаривания остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5744 и проявляли 6%-ным метанолом в хлороформе и получали целевое соединение I (1 ТО мг).

МК-спектр (КВг): 3300, 1650, 1505см 1. Тонкослойная хроматография: Rf 0,44 (Merck art 5715, смесь хлороформ-метанол в отношении 1.0:1).

25182697026

Получение 19мг). После перемешивания в течение 9 ч при

комнатной температуре порошок цинка (30 мг) добавляли к смеси с интервалами в 1 ч до

исчезновения исходного соединения а. По|Z jQf5 еле фильтрации растворитель удаляли в ваBoc-Asn-Ser-| с Qкууме. Остаток растворяли в этилацетате (10

z-Thr-N-c-c-Leu-D-Pha-OTceмл пР°мывали водой и выпаривали в вакуу ме. Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Мегек 5744),

исходное соединение а10 проявляли смесью этилацетат-ацетон-уксусная кислота-вода в отношении 6:3:1:1 по объ,.-ч-Онему и получали целевое соединение I (43,5

Bzi I н Qмг).

Boc-auo-Thr-Asti-ser-j oИК-спектр (КВг): 3300, 1650, 1505 .

z-rln-N-r г i15 Тонкослойная хроматография: ,16

nr-N с c-Leu-D-Phe-отсе (Merck art 5715 смесь хлороформ-тетанолeэцетол в отношении 10:1:0,1).

целевое соединение IПолучение 21

Исходное соединение а (105 мг) раство-К раствору фталальдегида (6.7 г) в дихряли в смеси 4 н. хлористого водорода в 20 лорметане (30 мл) добавляли этоксикарбо- диоксане (3 мл) и анизоле (0,1 мл). После нилметилентрифенилфосфоран (17,42 г) и перемешивания в течение 0,5 ч при комнат- смесь перемешивали 30 мин при комнатной ной температуре растворитель удаляли а ва- температуре. Растворитель выпаривали и ос- кууме. Остаток растворяли в дихлорметане таток растворяли в диэтиловом эфире. После (3 мл). К раствору добавляли N-трет-бутокси- 25 фильтрования смеси фильтрат выпаривали. карбонил-Ьаллотреонин (22 мг), триэтила- Остаток отгоняли под вакуумом (125°С, 0,6мм мин (9 мг), 1-оксибензотриэзол (12 мг) и рт. ст.) и получали этиловый эфир (Е)-3-{2-фор- растворимый в воде гидрохлорид кэрбодии- милфенил)-акриловой кислоты (6 г). мида (19 мг). После перемешивания в теме-Спектр ЯМР (СДС1з, б): 1,24 (ЗН, т. ,5

ние 8 ч при комнатной температуре к смеси 30 Гц), 4,19 (2Н, кв, ,5 Гц), 6,28(1Н,д, Гц), добавляли 7%-ную хлористоводородную (1Н, д, Гц), 7,5 (ЗН, м), 6,77 (1Н, м), 8,43 кислоту (5 мл). Органический слой промыва- (1Н, д, Гц). 10.18(1Н,с). ли водой. После выпаривали остаток под-Получение 22

вергали препаративной тонкослойнойК раствору бромистого бутилтрифенилхроматографии (Merck 5744) и проявляли 35 фосфония (3,2 г) в тетрагидрофуране (50 мл) 6%-ным метанолом в хлороформе и получа- добавляли трет-бутилат калия (900 мг) в атмос- ли целевое соединение I. фере азота и смесь перемешивали 30 мин при

Тонкослойная хроматография: ,73 комнатной температуре. К смеси добавляли (Merck an 5715, смесь хлороформ-метанол в раствор этилового эфира (Е)-3-{2-формилфе- отношении 5:1),40 нил)-акриловой кислоты (30 мл). Смесь переМК-спектр КВг): 3300,1740(плечо), 1650, мешивали 1 ч. После выпаривания 1500см 1.растворителя остаток растворяли в диэтилоПолучение 20вом эфире и промывали рассолом и водой.

онРаствор сушили над сульфатом магния,

Szi 45 фильтровали и выпаливали. Остаток подверBoc-auo-thr-Asn-ser-i чс отали хроматографии на колонке силикагеля

г -Thr-N-c-c-Leu-D-Phe-oTce г)и ЭЛЮИРОВЭЛИ смесью н-гексэн-этиламецетат в отношении 3:1. Фракции, содержащие целевое соединение, выпаривали и исходное соединение а50 получали этиловый эфир (Е)((г)-1-пентенил-фенил -акриловой кислоты (2,00 г).

t й . ;онЯМР-спектр (. б ): 0.38 (ЗН. т.

йпг П1| ru д Т ), 1,34(ЗН,т, ,5Гц), 1.42(2Н,н).2.05(2Н.

BoC-atlO-Thr-Asn-Ser-.С О7 лтгочi с cr- i-ne-/«iii -т

I ц iiм), 4,27 (2Н, нв, ,5 Гц), 5,85 (1Н, дт, и

2-Thr N-C-C-Leu-D-Phe-OH55 11 Гц), 6,39 (1Н, Д, Гц), 6.56 (1Н, Д.

МеГц), 7,3 (ЗН. м}, 7,61 (1Н, м), 7.92 (1Н, д,

Гц).

целевое соединение IПолучение 23

К раствору исходного соединения а (58,5К раствору этилового эфира (E)((z)-1 мг), в 90%-ном водном растворе уксуснойпентенил)-фенил -акриловой кислоты (2,0 г) в кислогы (1 мл) добавляли порошок цинкз (30

20%-ном водном метаноле добавляли гидроокись калия (2,3 г). Смесь перемешивали 2 ч при 60°С, устанавливали рН 1,0 хлористоводородной кислотой и экстрагировали этилацета- том. После просушивания экстрагировали этилзцетатом. После просушивания экстракта над сульфатом магния и фильтрации растворитель-удаляли выпариванием. Остаток растворяли в смеси гексан-этилзцетат в отношении 4:1. Этот раствор добавляли к ди- циклогексиламину (1,63 мл) и получали кристаллы. Кристаллы растворяли в этилацетате и промывали 1 н. серной кислотой. Рэстворсуши- ли над сульфатом магния, фильтровали, выпаливалииполучали(Е)-3-{2-((г)-пентенил)-фенил}-акриловую кислоту (0,92 г).

ИК-спектр(нуйол): 1690, 1680, 1620см 1,

Получение 24

(Е)((г)-1-Пентенил)-фенил)-акрилов- ую кислоту (1,08 г) растворяли в смеси дих- лорметана (10 мл), хлористого оксалила (0,5 мл) и N.N-диметилформамида (0,05 мл). После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере азота растворитель выпаривали. Остаток растворяли в нтексане и смеси фильтровали. Фильтрат выпаривали и получали хлористый (E)((z}-1- пентенил)-фенил -пропеонил (1,15 г),

ИК-спектр (чистый): 1750, 1730, 1605, 1585 .

ЯМР-спектр (, б ): 0,88 (ЗН, т, ,5 Гц), 1,45 (2Н. м), 2,06 (2Н,м), 5,95 (1 Н, дт. и 7 Гц),0 6,58 (tH, д,М 1 Гц), 6,66 (1Н, д. Гц), 7,4 (ЗН, м), 7,69(1 Н, м), 8,12 ОН, д, Гц).

Получение 25

Растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в этилацетате (10 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой.

После просушивания над сульфатом магния растворитель удаляли в вакууме и остаток растворяли в трифторуксусной кислоте (1 мл) и анизоле (0,1 мл).

После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворили в N.N-диметилформзмиде (2 мл) и смесь добавляли к пиридину (40 мл).

После перемешивания в течение 16 ч при комнатной температуре растворитель удаляли в вакууме. Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5744) и проявляли смесью хлороформ-метанола в отношении 10:1 и получали целевое соединение I (15,2 мг).

ИК-спектр (КВг), 1963, 1510см 1,

ЯМР-спектр (СДзОД) д : 6,24 (1Н, с),

аЗ&°:+13,0°(,1, метанол). Получение 26

,он

VCr

С оBzt

Z-TVir-N-c-c-Leu-D-Pbe-altO-Thr-Asn-Ser-i

Me

исходное соединение а

он

N

с о

AcOH-H-Thr-N-C-C-Ueu-D-Phu-QUo-Thr-Asn-Set- Ме

Использование: в фармакологии, поскольку получаемые пептиды-антагонисты к веществу Р, антагонисты к нейрокинину А (вещество К), пригодны для профилактики и лечения астмы. Сущность изобретения: способ получения производных пептидов WS- 9326А формулы 1 снсвшои, R-Thr-N((0)-Leu-DPhe-QU0Thr(R AsnSer(R ) где Р1-ар(низший) алканоил с Cs-алкилом в орто-положении; R2-H, низший алканоил, путем восстановления соединений общей формулы I, где R -ар(низший}алкеноил с Cs- алкенилом в ортоположении; Р2-значения указаны выше. 7 табл.. 10 ил.

тг1 н Boc-auo-Ttm-Asn-sef-i I II и

Z-Thr-N-c- C-Leu-D-phe-OH Me

исходное соединение а

он

с о

Н Н

I

Bzl

Z-Thr-ijj-c- C-Leu-D-Phe-auo-Thr-Asm-Ser -. L..

целевое соединение i

К раствору исходного соединения а (42 мг) в дихлорметане (4 мл) и N.N-диметилфор- мамиде (0,1 мл) добавляли N-оксисукципи- мид (20,4 мг) и водорастворимый солянокислый карбодиимид (8,2 мг).

После перемешивания в течение 15 ч при комнатной температуре к смеси добавляли водорастворимый гидрохлорид карбо- диимида (4 мг) с интервалами 1,5 ч до исчезновения исходного соединения а.

целевое соединение I

Исходное соединение а (22 мг) растворяли в растворе фтористый водород-пиридин (0,8 мл) и в анизоле (0,2 мл) в наполненном азотом мешке. После перемешивания в те- чение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавляли несколько кусочков льда и устанавливали рН раствора 8,0 водным раствором бикарбоната натрия. Смесь помещали в ионообменную колонку с дианоном НР-20 (10 мл) и промывали водой. Продукт элюировали метанолом и очищали тонкослоеной хроматографией (Merck 5715, смесь хлороформ-метанол-вода в отношении 3:1:0,1 по объему) и получали целевое соеди- некие I (13,0 мг).

ИК-спектр (КВг): 1635, 1510см 1.

ЯМР-спектр (СДзОД б ): 7,05 (1Н. с),

aft0: -90.6°(.1. метанол). Тонкослойная хроматография: RHX35 (Merck art 5715, смесь хлороформ-метанол- вода и отношении 3:1:0,1)

Получение 27

н

AcOH.H-rbr i Leu-D-phe-aUo Th,A;fi.Se

он

н

С nI R-C1 °ян°е

ц jf соединение Ь

R-Thr-N-c-c-Leu-D-Phe-auo-Thr-Asn-Ser- Ме

целевое соединение

Р-(Е)((7)-1-пентенил)-фенил -пропе- ноил.

К раствору исходного соединения а, (6,0 мг) в дихлорметане (1,5 мл), бис-(диметилои- лил)-цетамиде(30 мкл)и N.N-диметилформа- миде (0,3 мл) добавляли 0.02 в раствор исходного соединения в (0,4 мл). После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавляли 4-диметила- миногтиридин(0,1 мг). Исходное соединение добавляли к смеси с 30-минутными интервалами до исчезновения исходного соединения а. К смеси добавляли разбавленную хлористоводородную кислоту и органический слой промывали водой. После выпаривания в вакууме остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5715) и проявляли смесью хлороформ метанол-вода в отношении 65:25:4 по объему, Получали целевое соединение 1 (0,2 мг).

Это соединение было идентично соединению WS-9326A. полученному в Получении 28.

Получение 28.

Водная посевная среда (160 мл), содержащая растворимый крахмал (1 %), сахарозу 1 %), глюкозу (1 %), хлопковую муку (1 %), пептон (0,5%), соевую муку (0,5%) и карбонат кальция (0,2 %) (рН устанавливали 7,0 посредством 6н. гидроокиси натрия) была налита в каждую из двадцати 500 мл колб, Эрленмейера и стерилизована при 120°С в течение 30 мин.

Петлю культуры Streptomyces violaceoniger N° 9326 на скошенном агаре инокулировали в каждую из сред и выращивали на роторном вибраторе (220 об/мин, дуга качения 5,1 см) при 30°С в течение трех дней. Полученная посевная культура была внесена в 160 л стерильной ферментационной среды, содержащей глицерин (3%), соевую муку (0,5%). порошок сои (1,5%), карбонат кальция (0,2%) и йодистый натрий (Nal) (0,001%) в 200-литровом встряхиваемом бродильном баке из нержавеющей стали. Брожение проводили при 30°С три дня при аэрации 160 л/мин и перемешивании при 200 об/мин. Количество WS-9326A в бродильном бульоне оценивали количест- 5 венно методом высокопроизводительной жидкостной хроматографии с использованием насоса Hitachi модель 6555. Использовали колонку из стали (4,6 мм внутренний диаметр, высота 250 мм), упакованную R0 ODS-S (УМС-упакованная колонка) при скорости тока 1,0 мл/мин.

В качестве подвижной фазы использовали смесь метанола и воды в отношении 3:2. Пробу для высокопроизводительной

5 жидкостной хроматографии готовили следующим образом: равный обьем ацетона добавляли к бульону при энергичном перемешивании и выдерживали 1 ч и затем центрифугировали, 5 мл надосадочного слоя

0 иньецировали в инжектор проб Hitachi модель 655.

Выделение и очистка Равное количество ацетона добавляли к культуральному бульону (150 л) при переме5 шивании. Смесь выдерживали при комнатной температуре 1 ч и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали до 80 л при пониженном давлении, устанавливали рН 7,0 хлористоводородной кислотой и затем экс0 трагировали 80 л этилацетата. Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении и помещали на колонку силикаге- ля (кизельгель 60. 70-230 меш, 3 л). Колонку промывали н-гексеном (10 л), смесью н-гек5 сан-этилацетат в отношении 1:1 (10 л), эти- лацетатом (20 л) vf активное вещество элюировали из колонки ацетоном (6 л). Активные фракции сушили при пониженном давлении и подвергали колоночной хрома0 тографии на силикагеле (кизельгель 60, 70- 230 меш, Merck, 1,2 л). Колонку промывали смесью хлороформ-метанол в отношении 20:1 (5 с) и целевое соединение элюировали раствором хлороформ-метанол в отношении

5 10:1 (6 л). Фракции сушили при пониженном давлении, получали порошок. Порошок растворяли в небольшом количестве метанола и носили на колонку NS-геля (Nihon Seimitsu, 500 мл). Целевое соединение элю0 ировали смесью метанол-вода в отношении 8:2 (2 л) и концентрировали до 300 мл при пониженном давлении и затем экстрагировали 500 мл этилацетата. Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении

5 и получали порошок (5 г). Порошок (5 г) растворяли в 10 мл метанола (500 мг/мл) и под- вергэли высокопроизводительной жидкостной хроматографии с использованием стальной колонки (20 мм внутренний диаметр, 250 мм длиной), упакованной DОО5-5(УМС-упакованная колонка) и элюиро- озли смесью метанол-вода в отношении 8:2 при скорости потока 9,9 мл/мин, Полученную таким образом активную фракцию концентрировали при пониженном давлении и затем экстрагировали зтилацетатом. Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении и получали чисто-белый порошок (150 мг) WS-9326A.

Получение 29

К раствору WS-9326A (300 мг) в пиридине (4,5 мл) добавляли уксусный ангидрид (1,5 мл) и 4-диметиламинопиридин (1 мг) и реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривали досуха и получали масло, которое очищали препаративной тонкослойной хроматографией (смесь хлороформ-метанол о отношении 10:t).

Полученный продукт растирали с диэти- ловым эфиром и получали триацетил-WS- 9326А (332 мг) в виде бесцветного порошка. Физические и химические свойства триаце- TH/i-WS-9326A следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)цветная реакция: реакция положительная на сульфат церия, на серную кислоту и на пары иода;

отрицательная: реакция на нигидрин:

3)растворимость: растворяется в метаноле, диметилсульфоксиде; слабо растворим в хлороформе, диэтиловом эфире; нерастворим е н-гексане:

4)точка плавления: 141-143°С;

5)удельное вращение: а Ь3-122°(,0, метанол);

6)спектр ультрафиолетового поглощения

тметзнол Амакс

283нм( 132000);

7)молекулярная формула: CeoHy-sNeOie:

8)элементный анализ для CeoHy NsOiex х2Н20:

Вычислено, %: С 60,09; Н 6,56; N 9,34. Найдено, %: С 60,19; Н 6,42; N 9,27.

9)молекулярный вес: АВ-масс-спектр: m/z 1l63,6(M-tH)+

10)тонкослойная хроматография:

Проявляющий растворительСмесь хлоро- фом-метанол в отношении 10:1 по объему этилаце- тат

Значение Rf

0,50

0,12

)) спект р инфракрасного поглощения;

vЈfKrc 3350, 3020, 2950, 2920, 2850, 1730, 1650, 1520, 1440, 1350. 1230, 1200, 1160. 1100: 1060: 1040: 910

12)свойства вещества: нейтральное ве- щество;

13)спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 130: (100 МГц, СОС з-СОзОН в отношении 10:1), д:

174,20(с), 173,23 (с), 173,06 (с), 171,32 (с),

171,02 (с), 170,84 (с), 169,79 (с), 169,59 (с).

169,55 (с), 168,52 (с), 167,03 (с), 166,36 (с),

151,02 (с), 140,74 (д), 138,82 (с), 138,74 (с),

137,12 (с), 135,23 (д), 133,75 (с), 131,31 (с),

130,20 (д), 129,96 (д), 129,34 (д), 129,21 (д)х2,

128,56 (д)х2. 127,24 (д), 126,96 (д), 126,74 (д),

123,63 (д), 126,50 (д), 122,10 (д)х2, 121.29 (д),

70,99 (д), 69,22 (д), 63,22 (д), 73,73 (т), 58,13

(д), 56,10 (д), 53,22 (д), 52,66 (д), 52,18 (д),

49,93 (д), 39,75 (т), 39,39 (кв) 39,05 (т), 35,75

(т), 30,65 (г), 24,26 (д), 23.15 (кв), 22,79 (т),

21,42 (кв), 21,21 (кв), 20,99 (кв), 20,83 (кв),

17,05 (кв), 17,05 (кв), 16,18 (кв), 13,82 (кв)

график которого представлен на фиг. 4.

14)спектр ядерного магнитного резо- нанса на ядрах 1Н: (400 МГц, СОС з СОзОН

в отношении 10:1) д:

8,25 (1Н, д, (8 Гц), 8,02 (1Н, д, (8 Гц), 7,88 (1Н,д, Гц), 7,86(1 Н, д, Гц), 7,70 (1Н, д Гц), 7,61 (1Н, д Гц), 7,45 (1Н, д,

Гц), 7,32-7,15 (6Н. м, 7,03 (2Н, д, Гц), 7,00-6,94 (ЗН,м), 6,88-6,79(4Н,м), 6,70 (1Н, с), 6,49 (1Н, д, 1-12 Гц), 5,76 (1Н, дт и 7,5 Гц), 5,54 (1Н, широкий синглет), 5,50-5,45 (2Н, м), 4,93 (1Н, м), 4,75 (1Н, м), 4,65-4,56

(2Н, м). 4.46(1 Н,дд, и 11 Гц), 4,31 (Ж, т, Гц)., 4.22 (1 Н, м), 4,18 (1 Н, дд, и 11 Гц), 3,56 (ЗН, с), 2,90 (1Н, дд, и 16 Гц), 2,85- 2,80 (2Н, м), 2,56 (1Н, дд, и 16 Гц), 2,26 (ЗН.с), 2.00 (ЗН, с). 1,96-1,89 (2Н,м), 1,85 (ЗН,

с), 1,58 (1 Н, м), 1,35 (ЗН, д, Гц), 1,32-1,20 (ЗН, м), 1,07 (ЗН, д, Гц), 0,84(1 Н, м), 0,72 (ЗН, д, 6 Гц), 0,71 (ЗН, т, ,5 Гц), 0,65 (ЗН, д, Гц), график которого представлен на фиг. 5.

Получение 30

К раствору WS-9326A (100 мг) в пиридине (1 мл) добавляли уксусный ангидрид (0,01 мл) и смесь оставляли на ночь при комнатной температуре. Смесь выпаривали досуха,

чтобы получить масло, которое очищали препаративной тонкослойной хроматографией (смесь хлороформ-метанол в отношении 9:1), Полученный продукт растирали с диэти- ловым эфиром и получали моноацетил-WS9326А (55 мг) в виде бесцветного порошка. Физические и химические свойства моно- ацетил-УУ5-9326А следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)молекулярная форма: СббНто СЫ:

3)молекулярный вес: FAB-масс- спектр: m/z 1079,4 (М+Н)+;

4)тонкослойная хроматография:

Стационар- Проявляю- Значение Rf ная фаза щий растворитель

Пластинка Смеет хлоро-0,17

силикагеля форм-мета- (Merck artнол в

5715)отношении

10:1 по объему5) спектр инфракрасного поглощения:

гЈ1кс-3300. 2920, 1730, 1650. 1500. 1360, 1190, 1170, 910

6} свойства вещества: нейтральное вещество;

7) спектр ядерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц, СОС1з СОзОН в отношении 5:1): график которого представлен на фиг. 6.

Получение 31

К раствору WS-9326A (100 мг) в пиридине (1 мл) добавляли уксусный ангидрид (0,03 ммл) и смесь оставляли на ночь при комнатной температуре. Смесь выпаривали досуха и получали масло, которое очищали тонкослойной хроматографией (смесь хлороформ: метанол в отношение 9:1), что давало 72 мл диаметил WS-9326A в виде бесцветного порошка. Физические и химические свойства диацетил- Л/5-9326А следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)молекулярная формула: CseHTaNeOis;

3)молекулярный вес: FAB-масс-спектр: m/z 1121.4(М+Н)+;

4)тонкослойная хроматография:

Стационар- Проявляю- Значение Rf ная фаза щий раство-0,35

Пластинкаритель

силикагеля Смесь хлоро- (Merek art форм-мета- 5715)нол в

отношении 10:1 по объему

5)спектр инфракрасного поглощения:

. 3020, 2950, 1730, 1650, 1520,1500, 1360,1200, 1170, 1100, 1040,569, 910см 1.

6)свойства вещества: нейтральное вещество;

7)спектр ядерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц, CDCI.rCDsOD в отношении 5:1): график которого представлен на фиг. 7.

П ри м е р 1. WS-9326A(100 мг) растворяли в метаноле (2 мл) и раствор гидрогени- зировали над палладиевой чернью (25 мг) под давлением водорода в 1 атмосферу при

5 комнатной температуре в течение 4 ч. Смесь фильтровали и фильтрат выпаривали досуха при пониженном давлении. Образовавшийся продукт растирали с диэтиловым эфиром и получали тетрэгидро- Л/5-9326В (92 мг) в

0 виде бесцветного порошка. Физические и химические свойства тетрэгидро- Л/5-9326А следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)спектр ультрафиолетового поглоще- 5 ния;

ДЙ1«НОЛ 287 нм (е 13000); . 3) молекулярная формула: C54H72N80i3: 4) молекулярный вес: FAB-масс-спектр: m/z 1041,6(М+Н)+;

0 5) спектр ядерного магнитного резонанса на 13С(100 МГц, СОзОО), график которого представлен на фиг. 8;

6) спектр ядерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц. СОзОО), график которого 5 представлен на фиг. 9.

П р и м е р 2. Триацегил- Л/5-932бА (100 мг) растворяли в метаноле (3 мл) и раствор гидрогенизировали над палладиевой чернью (35 мг) под давлением водорода в 1 0 атмосферу при комнатной температуре в течение 3 ч.

Смесь фильтровали и фильтрат выпаривали досуха при пониженном давлении. Остаток растирали с диэтиловым эфиром и 5 получали тетрагидротриацетил-УУ5-9326А.

Физические и химические свойства тет- рагидротриацетил-У /5-9326А следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)спектр ультрафиолетового поглоще- 0 ния:

/ISIS1 1 280 нм ( е 13000):

3)молекулярная формула: СеоНтвМеОш;

4)элементный анализ для CeoHyeNgOie

Вычислено, %: С 60.80; Н 6,80; N 9,45. Найдено, %: С 61,08; Н 6,70; N 9.41.

5)молекулярный вес: FAB-масс-спектр: m/z 1167,6 (M+Hf;

Q б) спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 13С (100 МГц, СОС1з) б :

173,3 (с), 129,23 (д), 172.96 (с), 128,95 (д)х2, 172,90 (с). 129.61 (д)х2, 172.81 (с), 170.87 (с). 170.56 (с), 170,50 (с), 169,46 (с).

5 169,16 (с). 168,48 (с), 167,99 (с), 165,52 (с), 150,70 (с), 140,84 (с), 138,93 (с), 138,58 (с)„ 136.83 (с), 131,04 (с), 129,71 (д)х2, 128,61 (д)х2, 128,52 (д), Т26,80(д). 126,70 (д), 126,01 (д), 125,85 (д), 121.87 (д)х2х2, 70.49 (д). 69,10 (д), 63,32 (т), 58.28 (д). 56,19 (д). 52,63 (д), 52.07 (д). 51,63 (д), 49,23 (д), 39,30 (т), 39,17 (кв),

38,31 (т), 36,52 (т), 35,33 (т), 32,60 (т), 31,77 (т), 30,74 (т), 27,66 (т), 24,08 (д), 22,82 (кв), 22,50 (т), 21,46 (кв), 20,74 (кв) 20,63 (мв), 16,77 (кв), 16,77 (кв), 16,22 (кв), 13,97 (кв).

7) спектр ядерного магнитного резонанса на ядрах 1Н (400 МГц, СООз), 5:

8,18 (1Н, д, Гц), 7,66 (1Н, д. Гц), 7,65 (1 Н, д. (8 Гц), 7,29 (2Н, д. Гц), 7,22 (Ж, д, (8 Гц), 7,15-7,02 (12Н, м), 6,96 (1Н, д, Гц), 6,67 (1Н, с), 6,21 (1Н, широкий синг- лет), 5,51 (1 Н, широкий синглет), 5,43 (1 Н, м), 5,38 (1Н, широкий дублет, Гц), 4-85-4,75 (2Н, м), 4,66-4,58 (2Н. м), 4,40 (1Н, дд, и 6 Гц), 4,34 (1Н, м), 4,23 (1Н, дд, и 9 Гц), 4,07 1Н, м), 3,53 (ЗН, с). 3,04-2,84 (5Н, м), 2,75-2,50 (4Н, м), 2,46 (1Н, дд, и 5 Гц), 2,28 (ЗН, с), 1,99(ЗН,с). 1,85 (ЗН, с), 1,661,50 (ЗН, м). 1,37-1,27 (4Н,м), 1,27(ЗН, д, N7 Гц), 1,19(1Н, м), 1,08(ЗН, д, 7 Гц), 0,88 (1Н, м), 0,86 (ЗН, т. Гц), OJ2 (ЗН, д, Гц), 0,65 (ЗН,д, Гц).

Из анализа указанные выше физических и химических свойств и в результате дальнейших исследований по идентификации химической структуры химические структуры триацетил-У /3-9326А. моноацетил- и ди- ацетил- Л/5-9326В, тетрагидро- /УЗ-9326А и тетрагидротриэцетил- Л/3-9326А были идентифицированы следующим образом:

Триацетил- Л/3-9326А:

н Чс АсАс

R-Thr-N-C-c.-Leu-D-Phe-ailo-Thp-ASh-5e.r-, I MeI

Р-(Е}-3- 2-((7)-1-пентенил)фенил пропе 35

поил

моноацет - Л/3-9326А:

Hs0

С О R-Thr-N-C-C-be.u-D-Phe-aUo-Thr-Asr -Ser-.

. Ра. . ,

кчьШ

{Ь,КН2-((2)-1-пентенил}-фенил}-пропеноил

диацетип- Л/5-9326А

с-о.

1 И1

R-Tbr-N-C-C-Uu-D-Php alia T r-Asn-S«r-

. 1

R-lt/-j-t -uz;-1 -пёнтенил фенил}-пропе оил

тетрагидро-У /5-9326А

Он

0

С О

K-Tlr-Ы-О- C-Uu-D olio Ihr sn Ser, L ... .j

a

снгг.нг c-сн7сн2сн7сн7снч

(2-пентилфенил)-пропаноил тетрагидротриацетил 5-9326А

O-AC н 0

и иAc

R-Thr-N-c-c-Leu-0-Phe-auo-Thr-Asn-Ser-n | Hej

(2-пентилфенил)-пропаноил

П p и м е p 3. Следующие соединения

были получены в соответствии с методикой

примеров 1 и 2.

15

VJDОАС

R-Tht-N-c- C-Uu D-Phe-QUo-Thr-Asn-Ser-,

(2-пентилфенил)-пропаноил} TCX: ,17 Merck art 5715, CHCb- MeOH(10:1)J

ИК(Нуйол): 3300, 1760, 1730, 1650, 1530,

-1

1510, 1200, 1160, 1070,910см

н jCTaAc

s и Ялс

«-Thr-N-c-C-Leu-D-Phe-atto-Thr-ABn-Ser1 Me

L

3-(2-пентилфенил)-пропаноил

TCX: ,36 Merck 5715, CHCI3MeOH(10:1)j

ИК(нуйол): 3300, 1760, 1740, 1650, 1540,

а,н

с о

-Thr-tvi-c-C-Leu-D-Phe-aUo-Thr-ABn-Ser-, L 14

Р-3-(2-пентилфенил)-пропаноил 1Н-спектр ЯМР )269,65, МГц, СОзОО), д: 9,26,9,22,8,77.8,74,8,69,8,64,8,61,8,07, 8,04, 7,36, 7,33, 7,31, 7,30, 7,27, 7.26, 7,24, 7,21, 7,18, 7,16, 7,07, 7,06, 7,04, 7,03, 6,96, 6,82. 6,79, 5,05, 5,03, 4,96, 4,82, 4,81, 4,62, 4,58, 4,49, 4,24, 4,20. 3,95, 3,93, 3,91, 3,89, 3,73. 3,61, 3,56, 3,32, 3,31, 3,30, 3,07, 2,99, 2,94, 2,88, 2,87, 2,79, 2,73, 2,68, 2,64, 2,63. 1,36, 1.36, 1,33, 1.31, 3,23, 0,65, 0.61,

1,94, 1,57, 1,38,

0,58.

Формула изобретения Способ получения производных пепти- ДО8 WS-9326A общей формулы IOR

Ф

СН ОРГЦ

1II III,

R-Thr-N-C-C-beu-OPhe-dllo-Thr-Asn-Ser,

L.i j

где R эр (низший) алканоил с Cs-злкилом в ортоположении;

R 2 - водород или низший алканоил, отличающийся тем, что соединение общей формулы OR

НС О У И

RcL-Thr-N-C-c-Leu-DPhe-Qllo-Thr-ASh-Ser

сн

Культуральные характеристики штамма 9326

Среда

Агар с солодово-дрожжевым экстрактом

Агар из овсяной муки

Агар из крохмала и неорганических солей

Аспарагино-глицериновый агар

Агар на железе с лептонно-дрожжевым экстрактом

Тирозиновый агар

Глюкозо-аспарагиновый

где R а - ар (низший) алкеноил с Cs-алкени- лем в ортоположении;

о

R 2 - имеет указанные значения. подвергают реакции восстановления.

Таблица 1

Культуральные характеристики

G: хороший

А: обильный, коричневато-серый (6Е2)

R: темно-коричневый (7F6)

S: отсутствует

G: хороший

А: умеренный, темно-коричневый (7ЕЗ)

R: кочичневато-серый (7F2)

S: отсутствует

G: хороший

А: обильный, коричневатый серый (7Е2)

R: желтовато-коричневый (5Е6)

S: отсутствует

G: хороший

: обильный, коричневато-фиолетовый (19ЕЗ)

R: коричневый (6Е4)

S: отсутствует

G: хороший

А: тонкий, серовато-белый (IBt)

R: желтовато-коричневый (5D6)

S: отсутствует

G: хороший

А: обильный, коричневато-серый (9Е2)

R: коричневый до черного (6Е5)

S: отсутствует

G: хороший

А: умеренный, голубовато-серый

R: коричневый (6F4)

S: отсутствует

Среда

Питательный агар

Агар Беннетэ

Сахарозо-нитратный агар

Примечание: G-рост: А-воздушный мицелий; R-цвет обратоной стороны; S- растворимый пигмент.

Физиологические свойства штамма N° 9326

Условия

Температурный интервал для роста, °С Оптимальный интервал температур для роста, °С

Разжижение желатина Свертывание молока Пентонизация молока

Гидролиз крахмала

Продуцирование меланоидного пигмента Разложение целлюлозы

Усвоение углерода штаммом № 9326

Примечание + означает усвоение

Прололжение табл. 1

Культуральные характеристики

G: умеренный

: умеренный, коричневато-серый (9Е2) серовато-коричневый (5ЕЗ) до желтовато- коричневого (5F4) S: отсутствует

G: слабый

незначительный, темно-коричневый (6F4)

R: темно-кочичневый (6F4)

S: отсутствует

G:слабый А: отсутствует

R: серовато-кочичневый (6ЕЗ) S: отсутствует

Таблица 2

Характеристика

11-47

29-31

Положительно Отрицательно Положительно Положительно Отрицательно Отрицательно

Таблица 3

Таблиц 4

Влияние тетрагидро- Л/5-9326А или октапептида на специфическое связывание вещества Р с мембраной легких морской свинки

Таблица 7

Ингибирование вызванного нейрокинином сужения бронхов путем внутрибронхиального

введения тетрагидро- Л/5-9326А

Тетрагидро- Л/5-9326А растворяли в диметилсульфонсиде. 1 наномоль на 1 кг внутривенно.

г. 3 it 5В7 8 9 Ю 11 ft 13 Я15

woo зооо гаоа ш то та fzoo 1000 sou BOO

Фиг/

Таблица 5

Таблица б

С Cl OZ О Ok OS 04 С 00 05 ОС СИ C;t Dtl OVI OSt 091 Oil Cbi

о r- o

to

&

o-Vo - ч.,ц ikYnd : u ni; d:rauo

и ft

Г : . j. /5УИ niwl;r::iai Ji taucT jfii: H N

3

IiU. cneiTp oaou- e.r.lv S -Л ь CjICi-C; v f-)

t

г

OA69Z81

л

г

ГҐ1

о г- от

(О CV

00

С-54 50 .S45454IT I iOSS3

гм

ТТТТГ

oi ог at о os a о ое оь oot f о: °« ° 051 091 DEI оы

О Го

(О

см со

-C% в ОЛЗг- 5 -OvIl iU4Ji9i Jiifaiia ii ii- Up

t Ъч

«с

-$

15мни

15мин 15мм

№

2мин

гмин

t агонист {нейрокинш А ми хегрсеицим

f; антогонист (mesnpazi/dpo- Wf -ffSlffA) фиг

15/м/н 15мм 15мин fS/w#