СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УБИХИНОНА - 10 Российский патент 1994 года по МПК C12P7/66 C12N9/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения убихинона-10 (кофермента О₁₀), используемого в медицине для лечения ряда заболеваний, а также в качестве реактива при проведении научных исследований.

Известны способы получения убихинона-10 при помощи дрожжей из р. р. Сandida, Rhodotorula, Torulopsis, Sporidiobolus и др., предусматривающие культивирование дрожжей в периодических условиях на глюкозосодержащей среде с дрожжевым и кукурузным экстрактами и минеральными солями в аэробных условиях [1,2].

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ получения убихинона-10 при помощи культуры Сryptococcus curvatus ВКМ 2230, которая при выращивании на среде, содержащей глюкозу (3%), дрожжевой (0,4%) и кукурузный (0,1%) экстракты, минеральные источники азота, фосфора, некоторые минеральные соли, а также этанол (2% по объему), накапливает убихинон-10 в количестве 0,5-0,6 мг/г сухой биомассы, максимальное накопление убихинона-10 в 1 л культуральной жидкости составляло 4,02 мг, при содержании биомассы в среде 6,7 г [3].

Недостатками этого способа являются низкий выход биомассы, невысокое накопление убихинона-10 в 1 л культуральной жидкости, а также высокая стоимость 1 л среды за счет больших количеств дорогостоящего дрожжевого экстракта в ферментационной среде.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы, увеличение выхода убихинона-10 с 1 л культуральной жидкости, снижение стоимости ферментационной среды.

Это достигается путем культивирования дрожжей С.сurvatus ВКМ 2230 в аэробных условиях на среде, содержащей в качестве основного компонента молочную сыворотку 40-56%, дрожжевой экстракт 0,1-0,2%, минеральные источники азота, фосфора, некоторые минеральные соли, при этом в процессе ферментации вносят глюкозу для поддержания концентрации ее в среде в пределах 1,2-2,6%, сульфат или хлорид аммония 0,05-0,3%, а за 10-25 ч до окончания ферментации вносят 3-5% (по объему) этанола.

Использование в составе среды дешевого сырья - крупнотоннажного отхода производства - молочной сыворотки, которая служит источником углерода, витаминов, микроэлементов и т.д., обеспечивает накопление большого количества биомассы. Молочная сыворотка добавляется в среду в количестве 40-56% по объему. Добавление ее в меньшем или большем количестве приводит к снижению выхода убихинона-10 с 1 л культуральной жидкости за счет снижения выхода биомассы в первом случае и снижения удельного содержания убихинона-10 во втором. Добавление глюкозы в среду необходимо не только для увеличения биомассы. Поддержание концентрации глюкозы в среде в пределах 1,2-2,6% является необходимым условием повышения содержания убихинона-10 в клетках (до 0,2-0,5 мг/г СБ), в противном случае на среде только с молочной сывороткой содержание убихинона-10 в них очень низкое, 0,05 мг/г сухой биомассы и менее.

Дополнительное введение сернокислого или хлористого аммония 0,05-0,3% необходимо для обеспечения определенного уровня значений рН в пределах 2,7-3,2, при котором наблюдается повышение содержания убихинона-10 в биомассе, если концентрация глюкозы в среде находится в вышеуказанных пределах. Введение меньших количеств солей аммония не приводит к должному эффекту, больших количеств солей аммония - нецелесообразно.

Снижение рН среды за счет добавления неорганических кислот не приводит к увеличению количества убихинона-10. Добавление этанола 3-5% по объему за 10-25 ч до окончания ферментации необходимо для ингибирования роста культуры и повышения удельного содержания убихинона-10 в биомассе. Добавление этанола в меньших количествах является неэффективным, так как этанол быстро окисляется. Добавление его в больших количествах нецелесообразно, поскольку эффект тот же, что и при добавлении 5%.

Способ заключается в следующем.

Культуру дрожжей Cryptococcus curvatus ВКМ 2230 выращивали на среде следующего состава, %: молочная сыворотка 40-56 (по объему); сульфат аммония или хлористый аммоний 0,1-0,5; однозамещенный фосфат калия 0,2-0,5; сульфат магния 0,05-0,1; сульфат железа 0,001; сульфат цинка 0,0001; дрожжевой экстракт 0,1-0,2; рН перед стерилизацией 4,7-5,4; вода водопроводная до 6 л. Ферментацию проводят в аппарате "Биофер" объемом 10 л с 6 л среды, при подаче воздуха 1:2 (V : V), оборотах мешалки 900-1000 об/мин, температуре 28^оС. Во время ферментации в культуральную жидкость вносят глюкозу для поддержания концентрации ее в среде на уровне 1,2-2,6%, сернокислый или хлористый аммоний 0,05-0,3%. За 10-25 ч до окончания ферментации добавляют этанол 3-5% по объему. Процесс ферментации ведется в течение 65-72 ч. В конце ферментации клетки отделяют на центрифуге при 5000 тыс. об/мин. Выход биомассы составляет 60-116 г/л с влажностью 70-82%. Определение количества убихинона-10 в биомассе дрожжей проводят по модифицированной методике, описанной для определения кофермента О₁₀ в биомассе уксуснокислых бактерий. Для выделения фракции убихинонов используют ТСХ на пластинках Силуфол UV-254 в системе гексан:эфир (3:1). Содержание убихинона-10 в биомассе дрожжей составляет 0,2-0,5 мг/г сухой биомассы (СБ). Общее количество убихинона-10 с 1 л культуральной жидкости составляет 4,7-9,67 мг/л, что превышает количество убихинона-10, получаемого с 1 л культуральной жидкости в прототипе, в 1,17-2,4 раза.

П р и м е р 1. Дрожжи Сryptococcus curvatus ВКМ 2230 выращивают в аппарате объемом 10 л, содержащем 6 л среды следующего состава, %: молочная сыворотка 46 (по объему); сульфат аммония 0,3; однозамещенный фосфат калия 0,5; дрожжевой экстракт 0,23; сульфат магния 0,1; сульфат железа 0,001; сульфат цинка 0,0001; рН 4,8; вода водопроводная до 6 л. Ферментацию проводили при 28±1^оС, подаче воздуха 1:2 (V : V), перемешивании 900 об/мин. Глюкоза была добавлена через 23 и 48 ч от начала ферментации по 90 г, сульфат аммония 10 г через 48 ч, этанол 300 мл через 53 ч. Изменения концентраций глюкозы во время ферментации наблюдались в пределах 1,2-2,35%. Через 68 ч количество биомассы составляло 116 г/л при влажности 78%. Количество убихинона-10 в 1 г влажных клеток 0,048 мг. Количество убихинона-10 в 1 г культуральной жидкости составило 5,57 мг/л, что в 1,35 раза выше, чем в прототипе.

П р и м е р 2. Состав ферментационной среды такой же, как в примере 1, только содержание молочной сыворотки составляло 40% по объему; сульфата аммония 0,1% ; рН среды 5,5. Добавки глюкозы вносили через 22, 25, 31 ч по 90 г, сульфат аммония 10 г через 31 ч, этанол 250 мл через 43 ч от начала ферментации. Концентрация глюкозы в среде изменялась в пределах 1,25-2,6%. Через 68 ч культивирования количество биомассы составило 100 г при влажности 79% на 1 л среды. Количество убихинона-10 0,047 мг/г влажных клеток или 4,7 мг/л культуральной жидкости, что в 1,17 раза выше, чем в прототипе.

П р и м е р 3. Состав ферментационной среды такой же, как в примере 1, количество молочной сыворотки 56%, вместо сернокислого используется хлористый аммоний 0,3%, рН 4,9. Глюкоза по 90 г вносилась через 25%, 35 и 40 ч. Концентрация глюкозы в среде во время ферментации изменялась в пределах 1,2-2,6%. Сульфат аммония вносили по 5 г через 40 и 44 ч и по 10 г через 31 и 64 ч, этанол 300 мл через 46 ч. Через 70 ч от начала ферментации получено 100 г/л клеток с влажностью 71% и содержанием убихинона-10 0,0967 мг/г влажных клеток (0,333 мг/г СБ) или 9,67 мг с 1 л культуральной жидкости, что в 2,35 раза больше, чем в прототипе.

П р и м е р 4. Состав ферментационной среды такой же, как в примере 1, только количество молочной сыворотки 50%, дрожжевого экстракта 0,1%, рН 4,8. Глюкоза вносилась по 90 г через 20 и 45 ч от начала культивирования. Концентрация глюкозы во время ферментации изменялась в пределах 1,3-2,47%. Хлористый аммоний вносился по 5 г через 45 и 50 ч, 10 г через 55 ч. Вносился этанол 200 мл через 55 ч. Через 70 ч ферментации получено 62 г/л клеток влажностью 71,4%, с содержанием убихинона-10 0,145 мг/г влажных клеток или 0,5 мг/г СБ, или 8,22 мг/л, что в 2 раза превышало выход убихинона-10 по сравнению с прототипом.

П р и м е р 5. Состав ферментационной среды, как в примере 1, рН ферментационной среды 4,6. Глюкоза по 90 г вносилась через 25, 35, 45 ч от начала ферментации. Содержание глюкозы в среде во время ферментации варьировалось в пределах 1,26-2,55%. Сульфат аммония вносили по 5 г через 35 и 45 ч, 10 г через 50 ч, этанол 200 мл через 50 ч. Через 72 часа ферментации получено с 1 л 72,2 г биомассы влажностью 74,7%. Содержание убихинона-10 составляло 0,1006 мг/г влажных клеток, общее содержание 7,2 мг/л, что в 1,75 раза превышало данные прототипа.

П р и м е р 6. Состав ферментационной среды отличался от приведенного в примере 1 количеством сульфата аммония 0,5%, количеством дрожжевого экстракта 0,1% и начальным значением рН 4,85. Глюкоза по 90 г вносилась в процессе ферментации через 25 и 35 ч. Концентрация глюкозы в среде изменялась в пределах 1,22-2,28%. Вносился этанол 300 мл через 45 ч. Через 70 ч от начала ферментации собрано 60 г влажных клеток с 1 л культуральной жидкости с влажностью 71% . Содержание убихинона-10 в 1 л культуральной жидкости составило 6,18 мг, что в 1,5 раза выше, чем в прототипе.

П р и м е р 7. Дрожжи Сryptocoсcus curvatus ВКМ 2230 выращивают в аппарате V=10 л, содержащем 6 л среды следующего состава, %: молочная сыворотка 46 (по объему); (NH₄)₂SO₄ 0,5; КН₂РО₄ 0,5; дрожжевой экстракт 0,1; МgSO₄ 0,1; FeSO₄ 0,0001; ZnSO₄ 0,0001; рН 4,85. Вода водопроводная до 6 л. Ферментацию проводили при 28^оС, подаче воздуха 1:2 (V:V), перемешивании 900 об/мин. Глюкоза по 90 г вносилась в процессе ферментации через 25 и 35 ч. Концентрация глюкозы в среде изменялась в пределах 1,22-2,28%. Через 45 ч внесен этанол 300 мл и хлористый аммоний 3 г. Через 70 ч от начала ферментации собрано 60 г влажных клеток с 1 л культуральной жидкости с влажностью 71% . Содержание убихинона-10 в 1 л культуральной жидкости составило 6,18 мг, что в 1,5 раза выше, чем в прототипе.

П р и м е р 8. Условия проведения эксперимента такие же, как в вышеуказанном примере. Состав среды, %: молочная сыворотка 56,0; (NH₄)₂SO₄ 0,3; КН₂РО₄ 0,3; MgSO₄ 0,1; FeSO₄ 0,001; ZnSO₄ 0,0001; дрожжевой экстракт 0,1. рН среды 4,7. Глюкоза в количестве 45 г вносилась через 26 и 51 ч и 90 г через 45 ч. Изменение концентраций глюкозы во время ферментации наблюдалось в пределах 1,2-2,1%. Хлористый аммоний был внесен в количестве 2,5 г через 26 ч и по 1,25 г через 40 и 61 ч. Этанол в количестве 180 мл добавили через 56 ч. Через 66 ч количество биомассы составило 60 г при влажности 82% с содержанием убихинона-10 в биомассе 9,4 мг в 1 л культуральной жидкости, что в 2,34 раза больше, чем в прототипе.

Использование: биотехнология, медицина для лечения ряда заболеваний, а также в качестве реактива при проведении научных исследований. Сущность изобретения: осуществляют выращивание Cryptococcas curvatus ВКМ 2230 на среде, содержащей в качестве основного компонента молочную сыворотку, многотоннажный отход производства, при дополнительном введении в среду глюкозы, этанола и солей аммония, при одновременном снижении содержания дорогостоящего дрожжевого экстракта в 2 - 4 раза. Исключение из состава среды кукурузного экстракта позволило увеличить выход биомассы, повысить количество убихинона -10 в 1 л культуральной жидкости в 1,17 - 2,35 раза при одновременном снижении стоимости среды в 1,5 - 2,5 раза по сравнению с известным способом.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УБИХИНОНА - 10, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма-штамма дрожжей Cryptococcus curvatus ВКМ 2230 в аэробных условиях в присутствии источника углерода, минеральных источников азота, фосфора, глюкозы, дрожжевого экстракта, этанола, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, увеличения содержания убихинона и удешевления среды, в качестве источника углерода используют молочную сыворотку, глюкозу вводят в процессе культивирования, поддерживая ее концентрацию от 1,2 до 2,6 мас.% и дополнительно сульфат или хлорид аммония в концентрации от 0,05 до 0,3 мас.%, а этанол вносят за 10 - 25 ч до окончания культивирования в концентрации от 3 до 5 мас.%.