Способ получения формиатдегидрогеназы Советский патент 1989 года по МПК C12N9/04 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, и может быть использовано в процессе получения различных физиологически активных соединений (аминокислоты, стероиды, спирты и т. д.) с системой регенерации НАДН на основе формиатдегидрогеназы, для количественного определения муравьиной кислоты (формиат-ио- на) в сложных биологических смесях (сыворотка крови, культуральные среды, пищевые продукты), для создания биохимического топливного элемента,

-х|

использующего в качестве топлива метанол или формиат, а также в научных целях.

Цель изобретения - повышение выхода формиатдегидрогеназы за счет снятия репрессии биосинтеза фермента под действием легирующих добавок покрытия ферментеров.

Способ осуществляется следующим образом.

Бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют на синтетической питательной среде следующего состава, г/л: 2,0, сульфат аммония 2,0; хлорид натрия 0,5; сульСО

флт магния семнводный 0,0/5; растворимая соль вольфрамовой кислоты (калия, натрия, аммония и т. д.) как источник вольфрамата-иона 10 -10 3М} дистиллированная вода. Среду стерилизуют в течение 20 мин при 1 атм, рН среды после стерилизации 7,2. Отдельно готовят 10%-ный раствор дрожжевого автол зата, который стерилизует в течение 20 мин при 0,5 атм и вносят в среду из расчета 0,1-10 мл на 1 л среды. Метанол не стерилизуют и добавляют к среде до концентрации 1%. Посевной материал вносят в количестве 2-5%. Культивирование проводят в 100 л ферментере при 28°С,расходе воздуха 0,5:1 в течение 45-52 ч. Удельная активность формиатдегидрогеназыв бесклеточных экстрактах составляет 1600- 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. Выход биомассы 250-300 г сырых клеток.

Наиболее оптимальной является концентрация вольфрамат-иона от до 10 3М. В указанном диапазоне концентраций удельная активность формиатдегидрогеназы практически одинакова и составляет 1600- 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. При повышении концентрации вольфрамат-иона до М происходит резкое снижение скорости роста самой биомассы. При концентрации вольфрамата менее 10 М увеличения выхода фермента не наблюдается.

Исследование влияния иондв металлов на биосинтез формиатдегидрогеназы (табл.1) показывает, что большинство из них, почти не влияя на общий выход биомассы, вызывает резкое уменьшение активности формиатдегидрогеназы.

Как было показано с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, снижение активности формиатдегидрогеназы при культивировании в присутствии различных ионов металлов сопровождается уменьшением содержания самого фермента в клетках, т. е. эти ионы вызывают репрессию биосинтеза формиатдегидрогеназы. Единственным ионом, который не только не подавляет биосинтез фермента, а наоборот индуцирует увеличение содержания и уровня активности формиатдегидрогеназы в клетках, является вольфрамат- ион. Такое влияние вольфрамат-иона на биосинтез формизтдегидрогеназы в метилотровных бактериях в литератур

0

ньтх данных не описано. Предполагают, что вольфрлмат-ион каким-то обратом влияет на процесс утилизации формиа- та клетками.

Положительное влияние вольфрамата на выход формиатдедрогеназы подтвержден на примере ферментеров различной конструкции. При проведении культивирования в 100-литровых фермен-- терах отечественного производства, фирм Электролюкс (Швеция), Нордон, (Франция) и в 15-литровом ферментере 5 фирмы Ныо Браунсвик (США) величина удельной активности формиатдегидрогеназы составила 1000, 80, 92 и 410 нмоль/мин на 1 мг белка соответственно. При проведении культивирования в присутствии 10 М вольф5

0

5

рамата величина удельной активности независимо от типа ферментера составила 1640-1700 нмоль/мин на 1 мг белка. Выход фермента увеличился на на 70%, а в случае других ферментеров выход возрос в 4-21 раз.

Изобретение имеет важное значение, поскольку позволяет проводить крупномасштабное культивирование бакте- 0 рий Pseuclomonas sp. (10.1) ВКМВ-1545Д для получения формиатдегидрогеназы независимо от марки и объема ферментера с более высоким выходом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно известному способу в 100-литровом ферментере отечественного производства на минеральной среде следующего состава, г/л: , 2,0; сульфат аммония 2,0; хлорид натрия 0,5; сульфат магния семиводный 0,025; вода дистиллированная. рН среды после стерилизации 7,2. Во вр емя посева вносят 1% метанола и 0,2 мл 10%-го раствора дрожжевого автолизата на 1 л среды. Посевной материал вносят в количестве 2-3%. Режим ферментации: температура 28°С, расход воздуха 1:1, избыточное давление 0,5 атм, стерилизация при 120°С в течение 2 ч, паракультуру выращивают 48 ч. Удельная активность формиатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах составляет 1000 нмоль НАДН/мин на 1 мг белка.

II р и м е р 2. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ

0

5

0

5

В-1545Д культивируют согласно примеру 1, но в ферментере фирмы Электролюкс (Швеция). Удельная активность формиатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах составляет 80 нмоль/мин на 1 мг белка.

П р и м е р 3. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (1П1) ВКМ В-1545Д культивируют согласно примеру 2, но в минеральную среду перед стерилизацией вносят различные концентрации вольфрамата натрия. Влияние концентраций вольфрамат-иона на выход формиатдегидрогеназы представлен в табл. 2.

П р и м е р 4. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно примеру 1 , но в минеральную срецу перед стерилизацией добавляют вольфрамат калия в концентрации . Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет 1700 нмоль/мин на мг белка.

П р и м е р 5. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно примеру 1 , нов ферментере фирмы Нордон (Франция). Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет 92 92 нмоль/мин на 1 мг белка.

П р и м е р 6. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно примеру 5, но в минеральную среду добав- iляют вольфрамат аммония в концентрации . Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет 1670 нмоль/мин на 1 мг белка.

П р и м е р 7. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ

В-1545Д культивируют согласно примеру 1, но в ферментере фирмы Ныо Браунсвик (США). Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет 410 нмоль/мин на 1.мг белка.

П р и м е р 8. Метилотрофные бактерии Pseudomonas sp. (101) ВКМ В-1545Д культивируют согласно приме-

0 РУ 7, но в минеральную среду добавляют вольфрамат натрия в концентрации . Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет 1640 нмоль/мин на 1 мг белка.

5 Как следует из результатов экспериментов, приведенных в примерах 1-8, добавление в минеральную среду растворимой соли вольфрамовой кислоты позволяет повысить выход формиатдео гидрогеназы и снять репрессию ее биосинтеза тз любом типе ферментера.

Формула изобретения

5 Способ получения формиатдегидрогеназы, предсматривающий культивирование продуцирующих ее бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1545Д в аэробных условиях на синтетической пита0 тельной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метиловый спирт в качестве единственного источника энергии и углерода, отличающийся тем, что,

5 с целью повышения выхода целевого продукта за счет снятия репрессии биосинтеза формиатдегидрогеназы легирующими добавками материала ферментеров, в среду перед ее стерили0 зацией вносят растворимую соль вольфрамата в концентрации вольфрамата- иона .

Таблица 1.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для промышленного получения формиатдегидрогеназы. Целью изобретения является повышение выхода фермента за счет снятия репрессии его биосинтеза, вызываемого металлами, входящими в материал ферментера. Культивирование метилотрофных бактерий PSEUDOMONAS SP. 101 ВКМ В-1545Д, продуцирующих формиатдегидрогеназу, осуществляют на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве единственного источника углерода и энергии, в присутствии 10^-6 - 10^-3 М вольфрамат -иона. Удельная активность достигает 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. 2 табл.

3

4

MoOV

мпо;

1,05 1,13

64 63

8

Продолжение табл.1

Таблица2