Способ получения копропорфирина Ш Советский патент 1989 года по МПК C12P1/04 C12P17/16 C12P1/04 C12R1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения копропорфиринов.

Цель изобретения - ускорение биосинтеза.

Способ осуществляется следующим образом.

Для выращивания Arthrobacter glo- biforals используют питательную среду, содержащую, мас,%: глюкоза 0,5- 1,5, серно-кислый аммоний 0,05-0,15, питательная основа 2-,0-9,0 и вода, рН 7,0-7,2. В качестве питательной основы применяют кукурузный экстракт (5-6 мас.%) или смесь кукурузного экстракта с сухой молочной сывороткой или гидролизатом оболочек белково- витаминного концентрата (БВК). В

смеси концентрация кукурузного экстракта составляет 1-6 мас.%, а концентрация сыворотки или гидролизата оболочек БВК 1-3 мас.% от объема среды. Выращивание ведут в аэробных условиях, t 28-30 0, в течение 4-12 сут.

По окончании культивирования биомассу клеток отделяют на центрифуге или сепараторе, а накопившийся в фильтрате культуральной жидкости копропорфирин III адсорбируют на тальке. Тальк отфильтровывают, промывают подкисленной водой с рН 3,0 и копропорфирин III элюируют смесью ацетон - 1 н. НС1 (9:1 об/об). Ацетон отгоняют в вакууме и доводят рН водного раствора копропорфирииа III

4 00

to

CD 4ь Од

до 4,6. Выпавший осадок копропорфи- рнна III отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой и высушивают в эксикаторе над концентрированной серной кислотой, этерифи- цируют смесью метанол-концентрированная серная кислота (95:5 об/об), извлекают хлороформом и очищают на колонке с окисью алюминия третьей JQ степени активности (проявитель хлороформ) . Растворитель удаляют упариванием в вакууме, а осадок перекрис- таллизовывают из смеси хлороформ- метанол (1:5 об/об) и получают це- 15 левой продукт в форме тетрзметилово- го эфира.

Способ обеспечивает получение 60-240 мг/л тетраметилового эфира копропорфирина III в расчете на 20 культуральную жидкость.

Использование способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду состава, %: глюкоза 1,0, 25 кукурузный экстракт 5,0, аммоний серно-кнслый 0,1, дистиллированная вода остальное. Среду разливают в ка- чалочные колбы на 750 мл до 100 мл среды в каждую колбу и стерилизуют 30 при 0,5 атм в течение 30 мин. По окончании стерилизации колбы охлаждают до комнатной температуры 18- 20°С и инокулируют культурой A.globi- fomis ВКМ В-658, поддерживаемой в jc пробирках на косяках МПА. Общий объем среды для выращивания 1,1 л.

Колбы помещают в термостат при 28-30° С и проводят инкубацию в аэробных условиях на качалке при числе 40 оборотов 180 об/мин.

Через 48 ч ферментации в колбы ежедневно вносят глюкозу в виде 50,0%-ного стерильного водного раствора из расчета 1,0% глюкозы-на объем 45 культуральной жидкости, а также доводят рН среды до 7,0-7,2 10,С%-ным стерильным растворомоNaHCO,.

Через 12 сут выращивания ферментационную жидкость объединяют и клетки 50 бактерий отделяют на центрифуге при 6 тыс. об/мин. Получают 1 л густо окрашенного супернатанта. Доводят рН супернатанта до 3,0 добавлением 50,0%-ной уксусной кислоты и вносят 55 в него при перемешивании 200 мл активированной суспензии талька в 3%-ной уксусной кислоте. Суспензию готовят из расчета 2 г талька на

100 мл кислоты. Полноту адсорбции порфиринов на тальк контролируют спектрофотометрически. Через 1 ч тальк отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают на фильтре 3,0%-ным раствором уксусной кислоты. Порфирины элюируют 200 мл смеси аце- тон-1 н.НС (9:1 об/об) до прекращения окрашивания элюирующего раствора. Ацетон отгоняют в вакууме и порфирины осаждают из концентрированного водного раствора доведением его рН до 4,6 с помощью 20,0%-ного раствора едкого натра. Через 24 ч осадок порфиринов отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают охлажденной дистиллированной водой с рН 4,6. Осадок сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора в течение 24 ч, а затем помещают в охлажденную смесь метанол-серная кислота (95:5 об/об). Объем этерифицирующей смеси 50 мл. Через 24 ч этерификации, проводимой при комнатной температуре, разбавляю реакционную массу водой до 100С мл и метиловые эфиры порфиринов извлекают хлороформом (3 раза по 50 мл хлороформа). Хлороформ отгоняют в вакууме до конечного объема 3 мл и хроматографируют порфирины на колонке с окисью алюминия третьей степени активности (размер колонки 2, см) элюент хлороформ. Хлороформ отгоняют в вакууме досуха и кристаллизуют пор фирины из смеси хлороформ-метанол (1:5 об/об).

Вес полученного продукта 202 мг, т.пл. 152 С. Коэффициенты молярной экстинкции в хлороформе имеют следующие значения: 400 нм (), 499 нм (14М03), 532 нм (ЧО3), 567 нм (7хЮ3), 622 нм ().

Пример 2. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза 1,5, кукурузный экстракт 6,0, аммоний сер но-кислый 0,15. Продолжительность 12 сут. Остальное, как в примере 1. Выход копропорфирина III 225 мг/л к.ж

Пример 3. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза 1, кукурузный экстракт 1,0, молочная сыво ротка 1,0, аммоний серно-кислый 0,1. Продолжительность ферментации 4 сут. Остальное, как в примере 1. Выход копропорфирина III 103 мг/л к.ж.

Пример 4. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза 1,0, кукурузный экстракт 1,0, молочная

сыворотка 3,0, аммоний серно-кислый 0,1. Продолжительность ферментации 6 сут. Остальное, как в примере 1. Выход копропорфирина III 120 мг/л к.ж.

Пример 5. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза 1,0, кукурузный экстракт 1,0, гидролизат оболочек белково-витаминного концентрата (БВК) 1,0, аммоний сернокислый - 0,1%. Продолжительность ферментации 6 сут. Остальное, как в примере 1. Выход копропорфирина II 90 мг/л к.ж.

Пример 6. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза 1,0, кукурузный экстракт 1,0, гидролизат оболочек БВК 3,0, аммоний серно-кислый 0,1. Продолжительность ферментации 6 сут. Остальное, как в примере 1. Выход-копропорфирина III 106 мг/л к.ж.

П р. и м е р 7. Ферментацию ведут как в примере 1, но в качестве продуцента используют штамм Arthrobac- ter globifomis BKM В-660. Выход копропорфирина 195 мг/л к.ж.

Пример 8. Ферментацию ведут как в примере 1, но в качестве продуцента используют штамм Arthrobacte globiforrais BKM B-661. Выход копропорфирина III 180 мг/л к.ж

Пример 9. Ферментацию ведут на среде состава, %: глюкоза 0,5, аммоний серно-кислый 0,05, кукурузны экстракт 1, молочная сыворотка 1. Продолжительность ферментации 4 сут. Выход копропорфирина III 60мг/л к.ж.

Пример 10. Ферментацию ведут, как в примере 3, но питательная среда дополнительно содержит 3% молочной сыворотки. Продолжительность ферментации 12 сут. Выход копропорфирина III 240 мг/л к.ж.

Пример Т1. Ферментацию ведут, как в примере 2, но питательная среда содержит дополнительно 1% гидролизата оболочек БВК. Продолжительность ферментации 6 сут. Выход копропорфирина III 105 мг/л к.ж.

Пример 12. Ферментацию ведут, как в примере 3, но питательная среда содержит дополнительно 3% гид- 5 ролизата оболочек БВК. Продолжитель- ность ферментации 12 сут. Выход копропорфирина III 230 мг/л к.ж.

Пример 13. Ферментацию ведут, как в примере 1, но концентрация 0 глюкозы составляет 0,5%, серно-кисло- го аммония 0,05%. Выход копропорфирина III 195 мг/л к.к.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет уско- 5 рить процесс биосинтеза (до 12 сут. вместо 17 сут по известному способу).

i

Формула изобретения

Способ получения копропорфирина III 0 путем культивирования продуцента

Arthrobacter globiformis в питательной среде, содержащей глюкозу, питательную основу, соль аммония и воду, с последующим отделением биомассы 5 и выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости, отличающийся тем, что, .с целью ускорения биосинтеза, выращивание осуществляют на среде, со- 0 держащей в качествеtсоли аммония серно-кислый аммоний а в качестве питательной основы - кукурузный экстракт или смесь его с сухой молочной сывороткой или гидролизатом оболочек Q белково-витаминного концентрата при следующем соотношении компонентов, мае.%:

Глюкоза

Аммоний серно- 0 кислый

Питательная основа Вода

при этом кукурузный экстракт исполь- 5 зуют в концентрации 5,0-6,0 мас.%, а при использовании смеси кукурузный экстракт берут в концентрации 1- 6 мас.%, молочную сыворотку или гидролизат оболочек белково-витаминного концентрата - 1-3 мас.% от объема

0,5-1,5 0,05-0,15

2-9 Остальное

0

среды.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения - ускорение биосинтеза. Сущность способа сводится к тому, что продуцент ARTHROBACTER GLOBIFORMIS выращивают в питательной среде, содержащей, мас.%: глюкоза 0,5-1,5

аммоний сернокислый 0,05-0,15

питательная основа 2,0-9,0 и вода остальное. В качестве питательной основы может быть использован кукурузный экстракт (5-6 мас.%) либо смесь кукурузного экстракта (1-6 мас.%) с молочной сывороткой или гидролизатом оболочек БВК (1-3 мас.%). Культивирование ведут до 12 сут, затем отделяют мицелий и целевой продукт извлекают из фильтрата культуральной жидкости.