ШТАММ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/48 C12N1/16 C12P7/48 C12R1/73 

Изобретение относятся к биотехнологии и микробиологической промышленности, а именно к штамму дрожжей Yarrowia lipolytica продуценту лимонной кислоты и способу получения лимонной кислоты. Лимонная кислота широко используется в фармацевтической и пищевой промышленности для получения детергентов и для многих других целей.

Современное производство лимонной кислоты основывается на использовании мутантов гриба Aspergillus niger, в качестве сырья в основном используется меласса (свекловичная или тросниковая).

Однако меласса, будучи побочным продуктом производства сахара, обычно содержит около 50% ферментируемого сахара, который может быть превращен в лимонную кислоту; другие 50% это вода (20%) и органические и неорганическое вещества, которые не могут быть превращены в лимонную кислоту. Таким образом, максимальный выход лимонной кислоты на использованной мелассе не может превышать 30 40% обычно для получения 1 т лимонной кислоты требуется 2,5 - 3,5 т мелассы.

Более того, меласса не может быть использована в производстве лимонной кислоты без предварительной, по крайней мере частичной очистки.

Другой недостаток заключается в том, что технология получения сахара постоянно совершенствуется, содержание сахара в мелассе соответственно уменьшается, и ее качество ухудшается, а количество неиспользованных веществ возрастает. И поэтому представляется, что глюкоза и глюкозный сироп могут быть использованы в качестве альтернативных сырьевых материалов.

Следующий недостаток этого метода то, что мутанты гриба Aspergillus niger имеют тенденцию терять свою активность со временем, даже во время производства.

Больше того, как хорошо известно, производство лимонной кислоты методом глубинного культивирования с использованием A. niger один из наиболее технически сложных микробиологических процессов.

В последние годы дрожжи рассматривались в качестве перспективных продуцентов различных веществ, включая органические кислоты.

Обычно используют дрожжи рода Candida, а именно C. fibrae, C. subtropicalis, C. guilliermondii, C. lipolytica, C. oleaophila и C. zeylanoides.

Эти дрожжи, способные утилизировать различные источники углерода, растут на простой среде и легко растут в ферментерах при методе глубинного культивирования.

В различных патентах сообщается об использовании специально селекционированных мутантных штаммов дрожжей для получения лимонной кислоты; часто используют дрожжи Yarrowia lipolytica. Ранее эти дрожжи обозначались как вид Candida lipolytica или Saccharomycopsis lipolytica. Фактически, наименования Candida lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica и Yarrowia lipolytika являются синонимами.

Известно, что при культивировании диких штаммов на среде с различными источниками углерода накапливается лимонная кислота со значительной примесью изолимонной кислоты. Так на среде с н-алканами синтезируются примерно равные количества лимонной и изолимонной кислот [1, 2]
Таким образом, соотношение продуцируемых кислот, в первую очередь, определяется природой штамма и используемым источником углерода.

Известно, что штаммы Yarrowia lipolytica продуцируют лимонную кислоту при их культивировании на среде, содержащей различные соединения глюкозу, н-алканы [3, 4, 5] ацетат, глицерин, этанол в качестве источников углерода.

Патент ГДР [6] сообщает о возможности продуцирования лимонной кислоты дрожжами Saccharomycopsis lipolytica 181 ZIMET 43720 в среде, содержащей вышеуказанные соединения; однако никаких примеров или конкретных данных, касающихся осуществления, выхода и т.п. процесса с этанолом в качестве единственного источника углерода, не дано.

Финогенова Т.В. и др. [7] обнаружили, что дикий штамм Candida lipolytica 704 и его мутант N1 способны продуцировать лимонную кислоту при росте на среде с этанолом и дефиците источника азота.

Согласно этой работе способ получения лимонной кислоты включает культивирование дрожжей Candida lipolytica при интенсивной аэрации, с ростом продуцента, лимитированным источником азота (аммоний сульфат) в питательной среде, содержащей этанол, минеральные соли, дрожжевой автолизат и микроэлементы; поддерживают pH 6,0 7,0.

Концентрация лимонной кислоты с использованием мутантного штамма Candida lipolytica N1 в описанном методе 4,7 г/л; выход относительно добавленного субстрата 25 30% (вес/вес).

Мутантный штамм Candida lipolytica N1, известный как продуцент лимонной кислоты из парафина, при росте на среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода, продуцирует лимонную и изолимонную кислоты в концентрации 4,7 и 0,5 г/л, соответственно [8, 9] Суммарная продукция кислот 1,9 г на г биомассы.

Финогенова и др. [10] выращивая природный штамм дрожжей Candida lipolytica 704 продуцент трео-D (+)-изолимонной кислоты в 10-литровом ферментере, исследовали влияние условий культивирования на синтез изолимонной кислоты. Авторы показали, что данный штамм продуцируют при росте на этаноле преимущественно изолимонную кислоту, лимонная кислота накапливается в качестве побочного продукта. В данной работе ферментацию осуществляли при тех значениях pH среды (4,5; 6,0 и 7,0), в последнем случае образования кислот не происходило. Не было синтеза кислот также при концентрации кислорода в среде 30% от насыщения или ниже.

В начале культивирования среда содержала 15 г этанола на 1 л среды, а в период синтеза кислот 6,5 15,5 г на 1 л среды, при этом накапливалось 66 г/л изолимонной кислоты и 33 г/л лимонной кислоты (соотношение изолимонная кислота: лимонная кислота равно 2:1), выход лимонной кислоты 30% от потребленного этанола.

Таким образом, использование штаммов Candida lipolytica N1 и Candida lipolytica 704 не позволяет получать высокие концентрации и выходы лимонной кислоты на среде с этанолом. Кроме того, в случае использования в качестве продуцента дрожжей Candida lipolytica 704 в среде накапливается наряду с лимонной кислотой большое количество изолимонной кислоты, превышающее содержание первой. В связи с этим не представляется возможным выделение лимонной кислоты из ферментационной жидкости. Поэтому соответствующие промышленные процессы не осуществимы.

Задачей, не решение которой направлены предлагаемые объекты изобретения, является получение штамма-продуцента лимонной кислоты и разработка эффективного способа получения лимонной кислоты.

Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемых штамма-продуцента и способа получения лимонной кислоты, заключается в повышении концентрации лимонной кислоты в культуральной среде и выхода лимонной кислоты от субстрата.

Сущность объекта изобретения специально селекционированный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica НММ 217 (ВКМ Y-2785 D) продуцент лимонной кислоты. Штамм необходим для осуществления способа получения лимонной кислоты.

Сущность другого объекта изобретения способа получения лимонной кислоты заключается в том, что культивируют штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2785 D при аэробных условиях на питательной среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода, ионы Zn и Fe, при дефиците источника азота, при этом при непрерывной или дискретной подаче этанола его концентрацию в питательной среде поддерживают в пределах 0,1 30,0 г/л, причем преимущественно поддерживают концентрацию этанола в начале процесса 2,0 2,5 г/л; на стадии роста биомассы 1,0 2,0 г/л и 2,0 5,0 г/л на стадии биосинтеза лимонной кислоты.

Штамм Yarrowia lipolytica НММ 217 депонирован во Всесоюзной (теперь Всероссийской) коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии наук, 142292, г. Пущино, Московская область, проспект Науки 5, под номером ВКМ y-2785 D 10 июля 1992 года, в соответствии с Будапештским договором о международной регистрации депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Было найдено, что этот штамм способен расти на среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода, и что он не только хорошо растет на среде с этанолом, но также активно синтезирует лимонную кислоту на этом субстрате.

В последующем описании и пунктах формулы ссылка сделана на лимонную кислоту, однако следует понимать, что при ферментации в соответствии с реальным значением pH получают соли лимонной кислоты. При этом все сообщенные параметры (концентрации, выходы и так далее) относятся к лимонной кислоте. В качестве сырья могут быть использованы любые типы этанола, полученные химическим синтезом или ферментацией.

Содержание этанола в среде в области от 0,1 до 30,0 г/л, предпочтительно от 1,0 до 5,0 г/л.

Процесс ведут при непрерывной или периодической подаче этанола в среду.

Наименьшая величина времени процесса, а также наивысшее содержание лимонной кислоты в культуральной жидкости могут быть достигнуты поддержанием следующих концентраций этанола: в начале процесса 2,0 2,5 г/л; на стадии роста биомассы 1,0 2,0 г/л и 2,0 5,0 г/л на стадии биосинтеза лимонной кислоты.

Действие исходной концентрации этанола в среде не продолжительность лаг-фазы и время начала биосинтеза лимонной кислоты могут быть определены из табл. 2.

Ферментационная среда содержит следы следующих неорганических элементов: KI, B, Zn²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, Mo⁶⁺, Fe²⁺.

Концентрация Zn²⁺ в среде не менее 0,1 мг/л, предпочтительно 0,3 5,0 мг/л, наиболее предпочтительно 0,3 2,0 мг/л.

Концентрация Fe²⁺ в среде не менее 0,05 мг/л, преимущественно 0,1 1,0 мг/л.

В течение ферментации поддерживают pH среды в области от 3,2 до 8,0, преимущественно между 3,5 и 7,0, добавляя подходящее неорганическое основание, такое как гидроксид натрия, или гидроксид калия, или карбонат натрия, или карбонат калия и т.п.

Действие pH среды, концентрации цинка и железа на продукцию лимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica показано соответственно в табл. 3, 4, 5.

Ферментацию проводят в условиях перемешивания и аэрации, при которых концентрацию кислорода в среде поддерживают в диапазоне от 15 до 100% насыщения, предпочтительно от 50 до 80% насыщения.

В процессе культивирования поддерживают температуру 23 35^oC, преимущественно 26 30^oC.

Способ позволяет достигать концентрации лимонной кислоты 80 130 г/л и выхода 80 100% (вес/вес) от количества потребленного этанола.

Штамм Yarrowia lipolytica НММ 217 (ВКМ Y-2785 D) получен обработкой нитрозометилмочевиной штамма Yarrowia (Candida) lipolytica 704 и последующей селекцией на агаризованных и жидких средах с этанолом.

Предлагаемый штамм может быть охарактеризован следующим образом.

Характеристика штамма.

Культурально-морфологические признаки.

Трехсуточная культура в жидкой глюкозо-пептонной среде представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4,6 6,0 x 4,5 - 12,5 мкм. Небольшие округлые клетки 2,0 2,5 x 3,0 3,5 мкм встречаются также. Почкование полярное или латеральное. Клетки единичные или в цепочках, включающих 3 4 клетки.

Штрих на глюкозо-пептонном агаре непрерывный, плоский, блестящий, кремово-белого цвета, пастообразный, края ровные.

Колонии на сусло-агаре (возраст 4 недели) кремового цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, слегка шероховатые, тусклые, с фестончатым краем.

На 2 сут. роста на жидкой глюкозо-пептонной среде образуются тонкая пленка, кольцо на стенках, тяжелый осадок на дне пробирки.

На стекле, картофельном агаре на 5 сут. культура образует псевдомицелий типа Candida и Mycocandida.

Спор не образует.

Физиологические и биохимические признаки.

Строгий аэроб. Сахара не сбраживает.

Ассимилирует: глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит и молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты.

Не ассимилирует: сахарозу, мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты.

Не ассимилирует нитраты.

Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин, не требует биотин. Не растет на среде с 50% глюкозы.

Оптимальное pH 5,5 6,0.

Не растет при 37^oC. Максимальная температура роста 35^oC.

Разжижает желатин. Растет на алканах. Гидролизует мочевину.

Продуцирует лимонную кислоту на глюкозе, глицерине, этаноле, ацетате, алканах, жирах.

Эти свойства идентичны тем, что описаны в определителе Kreger van Riy "The Yeast. A taxonomic study". 1984, для дрожжей вида Yarrowia lipolytica.

Следует отметить, что штамм Yarrowia lipolytica НММ 217, предложенный в изобретении, отличается от Candida lipolytica N1 следующими признаками (табл. 1).

Таким образом, как указано выше, штамм, предлагаемый в данном изобретении, способен расти и продуцировать лимонную кислоту в широком диапазоне pH (3,2 8,0).

Изобретение далее иллюстрируются следующими примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1.

Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica НММ 217 поддерживают на косяках сусло-агара с пересевом один раз в два месяца при температуре 28^oC. После 3 сут. роста клетки с двух косяков переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды следующего состава, г/л:(NH₄)₂SO₂ 2,0, MgSO₄x7H₂O 0,7, Ca(NO₃)₂ 0,4, NaCl 0,5, K₂HPO₄ 0,1, KH₂PO₄ 1,0, дрожжевой экстракт 0,3, этанол 5,0, микроэлементы, мг/л: KI 0,1, B 0,01, Mn²⁺ 0,01, Cu²⁺ 0,01, Mo⁶⁺ 0,01, Fe²⁺ 0,05, Zn²⁺ 0,3. Дрожжи выращивают на качалке (200 об/мин) при 28^oC в течение 24 ч.

Через 24 ч проводят второй пересев на среде того же состава, этанол вносят периодически (0,5% исходно и по 0,5% по мере его потребления). Через 26 ч от начала культивирования pH среды поддерживают при 5,0 6,0 раствором 10% NaOH.

46-часовую культуру используют для инокулирования ферментера (10% от объема среды в ферментере) и проведения основной ферментации. Ферментацию проводят в 10-литровом ферментере АНКУМ-2М (Специального конструкторского бюро биологического приборостроения Российской академии наук).

Состав среды для ферментации, г/л: (NH₄)₂SO₄ 3,0, MgSO₄x7H₂О 1,4, NaCl 0,5, Ca(NO₃)₂ 0,8, K₂HPO₄ 2,0, K₂HPO₄ 0,2, ферментолизат 0,3, этанол 170 (вносят по мере потребления), микроэлементы, мг/л: KI 0,2, B 0,02, Mn²⁺ 0,02, Cu²⁺ 0,02, Mo⁶⁺ 0,02, Zn²⁺ 0,3, Fe²⁺ 0,6, вода бидистиллированная, объем среды 6 л.

Этанол вносят в среду следующим образом: перед засевом культуры 2,7 г/л (16 г на 6 л среды), затем после его потребления в фазе роста и размножения продуцента поддерживают этанол на уровне 1,3 г/л (с 17 до 24 ч), 2,0 г/л (с 24 до 36 ч), в период активного кислотообразования 5,0 г/л (с 36 до 95 ч), затем (с 95 до 118 ч) снижают до 2,0 г/л.

В процессе ферментации температуру поддерживают 28^oC, pH 4,5 доводят раствором 20% NaOH, концентрация кислорода 60% от насыщения.

Через 5 сут. культивирования концентрация лимонной кислоты 130 г/л, изолимонной кислоты 9,5 г/л, выход лимонной кислоты 90% от внесенного этанола.

Лимонную кислоту определяют двумя методами: химическим путем окисления KMnO₄ (Жаболовская Н.А. и др. Хлебопекарная и кондитерская промышленность, 5: 22 24, 1968) и энзиматическим (Methods of enzymatic food analysis. Boehringer Mannheim, 1984, р. 13 14).

Изолимонную кислоту определяют энзиматическим методом (Methods of enzymatic food analesis. Boehringer Mannheim, 1984, р. 31 32).

Пример 2.

Ферментацию проводят, как в примере 1, за исключением того, что этанол вносят непрерывно, поддерживая концентрацию 2,0 г/л в течение всего процесса, концентрация Zn²⁺ в среде 0,5 мг/л, а pH в течение ферментации поддерживают на уровне 6,0.

Через 5 сут. ферметации концентрация лимонной кислоты 103 г/л, концентрация изолимонной кислоты 9,9 г/л, выход лимонной кислоты 83% от внесенного этанола.

Пример 3.

Ферментацию проводят, как в примере 1, за исключением того, что вместо ферментолизата используют дрожжевой экстракт (0,5 г/л), концентрация Zn²⁺ 0,5 мг/л, в течение ферментации pH поддерживают 6,0.

Через 5 сут. культивирования концентрация лимонной кислоты 102 г/л, концентрация изолимонной кислоты 7,0 г/л, выход лимонной кислоты 92% от внесенного этанола.

Пример 4.

Ферментацию проводят, как в примере 3, за исключением того, что pH во время ферментации поддерживают 3,7.

Через 5 сут. культивирования концентрация лимонной кислоты 107 г/л, концентрация изолимонной кислоты 5,6 г/л, выход лимонной кислоты 85% от внесенного этанола.

Влияние условий культивирования на выход лимонной кислоты показано в последующих табл. 2 5.

Предлагаемые в данном изобретении штамм-продуцент лимонной кислоты и способ получения лимонной кислоты позволяют значительно повысить концентрацию лимонной кислоты в жидкой культуральной среде до 130 г/л и выход кислоты от этанола до 90 100% (вес/вес) от массы этанола.

Другие преимущества предлагаемого способа:
1) основное сырье этанол (полученный химическим путем или ферментацией), который практически полностью переходит в конечный продукт;
2) продуцентом являются нетоксичные и непатогенные дрожжи Yarrowia lipolytica, которые хорошо растут на этаноле, давая высокую концентрацию и высокий выход конечного продукта от этанола;
3) при использовании этанола в качестве сырья и дрожжей как продуцента ферментационная жидкость является очень чистой, и процесс выделения - упрощенным;
4) изолимонная кислота, которая является основным сопродуктом ферментационного процесса, составляет менее 10% от лимонной кислоты.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: новый штамм дрожжей - продуцент лимонной кислоты и способ ее получения. Предлагаются штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y - 2785 D - процент лимонной кислоты и способ получения лимонной кислоты, включающий культивирование дрожжей Yarrowia lipolytica на питательной среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода и ионы цинка и железа в качестве микроэлементов, при дефиците источника азота в условиях аэрации, характеризующийся тем, что культивируют штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y - 2785 D на питательной среде, при этом подавая этанол непрерывно, этанол поддерживают в питательной среде в количестве 0,1 - 30,0 г/л, а при дискретной его подаче поддерживают концентрацию этанола на следующих уровнях: 2,0 - 2,5 г/л в начале процесса, 1,0 - 2,0 г/л во время роста биомассы, 2,0 - 5,0 г/л на стадии биосинтеза лимонной кислоты. Концентрация лимонной кислоты в культуральной среде до 130 г/л и выход кислоты от этанола до 90 - 100 вес.%. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2785-D продуцент лимонной кислоты. 2. Способ получения лимонной кислоты, включающий культивирование дрожжей Yarrowia lipolytica на питательной среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода, ионы цинка и железа в качестве микроэлементов, при дефиците источника азота в условиях аэрации, отличающийся тем, что культивируют штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2785-D, при непрерывной или дискретной подаче этанола его концентрацию в питательной среде поддерживают в пределах 0,1 30,0 г/л, при поддержании концентрации этанола в начале процесса 2,0 2,5 г/л, на стадии роста биомассы 1,0 2,0 г/л и 2,0 5,0 г/л на стадии биосинтеза лимонной кислоты. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что процесс ведут при концентрации ионов цинка и железа в указанной среде не менее 0,1 и 0,05 мг/л соответственно. 4. Способ по пп. 2 и 3, отличающийся тем, что процесс ведут при концентрации ионов цинка в указанной среде в диапазоне 0,3 2,0 мг/л и ионов железа в диапазоне 0,1 1,0 мг/л. 5. Способ по пп. 2 4, отличающийся тем, что штамм дрожжей культивируют при значениях pH 3,2 8,0, предпочтительно 3,5 7,0. 6. Способ по пп. 2 5, отличающийся тем, что указанный штамм дрожжей культивируют при содержании кислорода в среде при величине насыщения 15 - 100%
7. Способ по пп. 2 6, отличающийся тем, что содержание кислорода в среде поддерживают равным 50 80% насыщения. 8. Способ по пп. 2 7, отличающийся тем, что указанный штамм дрожжей культивируют при 23 35^oС. 9. Способ по пп. 2 8, отличающийся тем, что указанный штамм дрожжей культивируют преимущественно при 26 30^oС.