СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРИММУНОГЛОБУЛИНЕМИИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для качественной экспресс-диагностики гипериммуноглобулинемий.

Различные типы нарушений гуморального иммунитета, проявляющиеся качественными и количественными изменениями иммуноглобулинов, сопровождают заболевания различной нозологии, включая парапротеинемические гемобластозы, разнообразные формы гуморальных иммунодефицитов, аутоиммунную и иммунокомплексную патологию, а также заболевания, связанные с сильной и длительной антигенной стимуляцией или с нарушением регуляции иммунного ответа.

Иммуноглобулины представляют собой семейство структурно-сходных белковых молекул, обладающей функцией антител. Структурные, антигенные и биологические особенности иммуноглобулинов, генетические и клеточные основы их биосинтеза широко известны.

Диагностика гипериммуноглобулинемий требует качественной и количественной характеристики иммуноглобулинов в сыворотке крови (СК). Такая характеристика может быть получена при помощи иммунохимических методов, основанных на взаимодействии исследуемых белков с антителами специфических реагентов - антисывороток. Иммунохимические методы позволяют определить количество иммуноглобулинов разных классов, выявить их структурные особенности, обнаружить разные по структуре комплексы иммуноглобулинов. Основу всех методов составляет иммунопреципитация и электрофорез, применяемые раздельно или в комбинациях.

Известен способ исследования содержания иммуноглобулинов в СК методом иммуноэлектрофореза. Принцип метода заключается в сочетании электрофореза в агаровом теле с иммунодиффузией. Классический вариант состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретическое разделение белков в забуференном теле агара, после разделения в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и формы которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

По расположению линий, их форме, интенсивности можно судить о качественных особенностях исследуемых белков и иногда об их количестве. Иммунохимическая идентификация линий основана на использовании моноспецифических антисывороток.

Способ включает следующие операции: приготовление агаровых пластин; формирование лунок и канавок в геле; проведение электрофореза; внесение антисыворотки; иммунодиффузия на протяжении 24 ч; элюирование 3 сут, окрашивание; фотографирование.

При осуществлении предлагаемого способа используют следующие материалы и оборудование: предметные стекла, пробирки, пипетки на 10 мл, препаравальную иглу, фильтровальную бумагу, ледяную кислоту, веронал-натрий, комплект приборов для электрофореза, источник тока, электрофоретическую камеру, штампы, водяную баню, стеклорез, ванночки для окрашивания предметных стекол и фотооборудование.

Все перечисленное затрудняет возможность широкого применения способа, в связи с чем уменьшается возможность ранней диагностики гипериммуноглобулинемий.

Цель изобретения - упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом. Моноспецифические сыворотки, взятые из стандартного набора против иммуноглобулинов A, M, G и сыворотки крови исследуемого лица раздельно в виде капель (3-5) объемом 0,01-0,03 мл каждая наносят на предметные стекла, накрывают покровными стеклами и высушивают в эксикаторе с влагопоглотителем, помещенном в суховоздушный шкаф при Т = 35-37^оС на протяжении 2-4 ч, затем микроскопируют.

Кристаллоскопическое исследование выполняют в биологическом микроскопе ЛОМО. В качестве эталона используют моносыворотки, взятые из набора стандартных сывороток Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии.

Для проб использованы СК больных с заболеваниями крови (острый миэлолейкоз, хронический лимфолейкоз), с аутоиммунными расстройствами (неспецифический язвенный колит, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, системная склеродермия).

При изучении образцов, приготовленных из моносывороток (эталон) и сывороток исследуемых больных (проба), были выделены главные микроформы (кристаллы типы ледяных узоров) и соподчиненные (веретенообразные агрегаты и спирали). Облик кристаллов типа ледяных узоров был специфичен в соответствии с видом гипериммуноглобулинемии (веретенообразные агрегаты и спирали) встречались во всех случаях гипериммуноглобулинемий, но в разном соотношении.

П р и м е р 1. Получен микротип сыворотки крови (СК) больной с острым миэлолейкозом, повышено содержание IgA (3,1 г/л при норме 1,52 г/л). Присутствует скелетный кристалл типа ледяных узоров, пятилучевой.

Технология: две-три капли сыворотки крови больного объемом 0,02 мл каждая наносят на предметное стекло, каждую накрывают покровным и помещают в эксикатор с влагопоглотителем, сушат в суховоздушном шкафу на протяжении 4 ч при Т = 37^оС, затем микроскопируют.

П р и м е р 2. Получен микротип сыворотки крови больного с ревматоидным артритом, повышено содержание IgA (5,4 г/л). Присутствует пятилучевой кристалл, веретенообразные агрегаты.

Технология: капли сыворотки крови исследуемого больного (3-5) наносят на предметное стекло, объем каждой капли 0,02 мл, затем их накрывают покровными стеклами и сушат в эксикаторе с влагопоглотителем, помещенном в суховоздушный шкаф на протяжении 3 ч при Т = 36^оС. Полученный препарат микроскопируют.

П р и м е р 3. Получен микротип сыворотки крови больного с системной склеродермией, повышено содержание IgM (4,4 г/г при норме 1,1 г/л). Присутствует крупный четырехлучевой скелетный кристалл типа ледяных узоров.

Технология: капли сыворотки крови больного объемом 0,03 мл каждая наносят на предметное стекло, каждую накрывают покровным и сушат 2 ч при Т = 37^оС в эксикаторе с влагопоглотителем, помещенном в суховоздушный шкаф, затем микроскопируют.

П р и м е р 4. Получен микротип сыворотки крови больного с хроническим миэлолейкозом, повышено содержание IgM (2,8 г/л) виден скелетный кристалл четырехлучевой (лучи удвоены) спиралеобразный агрегат. Технология: сыворотка крови в виде капель (две-три) объемом 0,01 мл каждая наносят на предметное стекло, накрывают покровными стеклами, помещают в эксикатор с влагопоглотителем, который находится в суховоздушном шкафу, сушат 4 ч при Т= = 36^оС, затем микроскопируют.

П р и м е р 5. Получен морфотип СК больной с системной красной волчанкой, повышено содержание IgA (3,4 г/г) присутствует пятилучевой скелетный кристалл типа ледяных узоров.

Технология: капли сыворотки объемом 0,03 мл каждая наносят на предметное стекло, накрывают по отдельности покровными и сушат в эксикаторе с влагопоглотителем, помещенном в суховоздушный шкаф, на протяжении 20 ч при Т = 36^оС, полученный препарат микроскопируют.

П р и м е р 6. Получена микроструктура СК больного с хроническим лимфолейкозом, присутствуют скелетные кристаллы типа ледяных узоров, трехлучевой, отдельная ветвь луча или отдельный луч. Содержание IgA равно 2,8 г/л, норма 1,52 г/л. Технология аналогична примеру 2.

П р и м е р 7. Получены микрофорфотипы СК больного с узелковым периартериитом. Присутствуют отдельные лучи с ветвящимися под углом ветвями, веретенообразные агрегаты. Повышено содержание IgG (20,2 г/л при норме 8,82 г/л).

Технология: капли сыворотки крови исследуемого больного (две-три), объем каждой - 0,03 мл, наносят на предметное стекло, затем капли накрывают покровными стеклами, помещают в эксикатор с влагопоглотителем, который находится в суховоздушном шкафу, сушат 4 ч при Т = 35^оС, полученный препарат микроскопируют.

П р и м е р 8. Получены микротипы из СК больного с неспецифическим язвенным колитом, присутствует реликтовый скелетный кристалл, ветви которого отходят под острым углом от основного хода луча, а виден мелкий скелетный кристалл, спиралеобразный агрегат, также присутствует крупный скелетный кристалл, ветви которого отходят под углом от основного хода луча. Повышено содержание IgG (21,2 г/л).

Технология: капли сыворотки крови больного (две-три) наносят на предметное стекло, объем каждой капли равен 0,02 мл, капли накрывают покровными стеклами, сушат в эксикаторе с влагопоглотителем, помещенном в суховоздушный шкаф, на протяжении 4 ч при Т = 37^оС, затем микроскопируют.

П р и м е р 9. Получен микротип сыворотки крови здорового человека. Присутствуют нитевидные ветвящиеся кристаллы.

Технология: капли сыворотки крови здорового человека наносят на предметное стекло, объем каждой - 0,03 мл, затем накрывают покровными стеклами и сушат в эксикаторе с влагопоглотителем, помещенном в суховоздушный шкаф при Т = 36^оС, на протяжении 3 ч. Полученный препарат микроскопируют.

Эффективность предлагаемого способа по сравнению с прототипом заключается в том, что по типам кристаллов, полученных при высыхании в сыворотке крови исследуемого лица, можно установить качественно наличие гипериммуноглобулинемии, при этом гипериммуноглобулинемии A соответствуют преимущественно пяти- и трехлучевые кристаллы или их отдельные лучи, при гипериммуноглобулинемии М присутствуют преимущественно четырехлучевые кристаллы или их отдельные лучи, при гипериммуноглобулинемии I присутствуют преимущественно скелетные кристаллы с ветвями, отходящими под углом от хода основного луча.

Способ прост в техническом исполнении, доступен, не требует дорогостоящей аппаратуры и может быть использован при массовых осмотрах в поликлинике и стационаре.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии. Цель изобретения - упрощение способа. У больного берут кровь, выделяют сыворотку, наносят на предметное стекло, инкубируют при температуре 35 - 37°С в течение 2 - 4 ч. Под микроскопом сравнивают микроформы с контролем и при их совпадении диагностирут гипериммуноглобулинемию. По сравнению с прототипом упрощается диагностика.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРИММУНОГЛОБУЛИНЕМИИ, включающий забор крови, выделение сыворотки с последующим ее исследованием, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, исследование сыворотки осуществляют на стекле, при этом наносят раздельно каплю сыворотки больного и каплю гиперглобулиновой сыворотки, накрывают их покровным стеклом и инкубируют при 35-37^oС в течение 2-4 ч, далее под микроскопом сравнивают микроформы кристаллов в обеих каплях и при одинаковых микроформах диагностируют гиперглобулинемию.