СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРКОРТИЗОЛЕМИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/74 

Предполагаемое изобретение относится к медицине, физиологии и может быть использовано для диагностики ситуаций, связанных с высоким содержанием кортизола в организме человека. Диагностическое значение определения кортизола в различных отделах медицины резко возрастает.

Кортизол - стероидный гормон, выделяемый корой надпочечников. Он составляет 75-90% кортикоидов, циркулирующих в крови, и регулирует все физиологические и биохимические процессы в организме.

Содержание кортизола в крови увеличивается:
- при заболеваниях гипоталамо-гипофизарной системы, связанных с усиленным выбросом адренокортикотропного гормона (АКТГ), способствующего повышению функции коры надпочечников;
- при заболеваниях коры надпочечников (гиперплазия, гипертрофия, аденома, киста, опухоль),
- при гипотиреозе, циррозе печени, астме, сахарном диабете;
- при АКТГ-эктопированном синдроме;
- при беременности;
- при постоянном приеме глюкокортикоидов в целях повышения защитных свойств иммунной системы.

В клинике синдром гиперкортизолизма наблюдается в виде:
- болезни Иценко-Кушинга;
- синдрома Иценко-Кушинга (кортикостерома - доброкачественная или злокачественная, двусторонняя мелкоузловая дисплазия коры надпочечников);
- при наличии опухолей бронхов, поджелудочной железы, печени, яичников, секретирующих АКТГ и кортикотропин-рилизинг гормон (КРГ);
- синдроме феминизации и вирилизации;
- при раке щитовидной железы, молочных желез, желудка, толстой кишки (Назаренко Г. И. , Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М., 2000. - С. 404-407; Bates S.E. et al., 1985).

Концентрация кортизола в крови повышается при стрессе, болевом синдроме, лихорадках, менингитах, опухолях ЦНС, акромегалии, правожелудочковой недостаточности, почечной гипертензии, психической депрессии, приеме синтетических аналогов глюкокортикоидов (преднизолон, преднизон), эстрогенов, амфемина.

Клиническое использование синтетических глюкокортикоидов, содержащих кортизол (кортикостерон), на протяжении длительного времени при таких заболеваниях, как диффузные заболевания соединительной ткани, астма, острый лейкоз, нейродермиты, экзема, аллергические заболевания (анафилактический шок. сывороточная болезнь, ангионевротический отек) может привести к синдрому передозировки, к развитию фармакологического синдрома гиперкортизолизма (П. В. Сергеев, П.А. Галенко-Ярошевский, Н.П. Шимановский. Очерки биохимической фармакологии. М., 1996).

Концентрацию кортизола в сыворотке крови обычно оценивают иммунохимическими способами (радиоиммунологическим, иммуноферментным). Используют набор реактивов Стерон-К^-1251-М (Инструкция по применению набора реактивов для радиоиммунологического определения кортизола в сыворотке крови человека с использованием кортизола, меченного J¹²⁵ и преципитирующего реагента Стерон-К^-125 1-М. Минск.: Пламя, 1988.

Для иммуноферментного способа используется тест-набор "Стероид ИХЛА КОРТИЗОЛ" ЗАО "Алкор-Био", Россия. С.Петербург, ул. Корпусная, 28а.

Вышеуказанные способы наряду с несомненными достоинствами (высокая чувствительность и специфичность) имеют ограничения в применении. Проведение хода исследования трудоемко, требует длительного времени.

Так, например, для проведения радиоиммунологического определения кортизола сыворотки крови человека необходимо наличие набора, в состав которого входят:
1) J¹²⁵ кортизол, лиофилизованный препарат, 1 флакон, общая активность 90-180 кБк;
2) 7 калибровочных проб сыворотки крови, содержащих известные количества кортизола - 0, 20, 50, 150, 400, 1000, 2000 нмоль/л после растворения, лиофилизованные препараты или жидкости;
3) буферный раствор;
4) антисыворотка;
5) преципитирующий реагент.

Принцип работы набора состоит в следующем:
1) компоненты набора и образец сыворотки крови J¹²⁵ - кортизол и эндогенный кортизол вступают в обратную иммунохимическую реакцию с кроличьими антителами против кортизола;
2) одновременно с этой реакцией протекает взаимодействие антител против кортизола со вторыми антителами (против иммуноглобулинов кролика) и в результате образуется тройной комплекс;
3) количество связанного антителами J¹²⁵-кортизола находится в обратной зависимости от концентрации кортизола в системе:
4) концентрация кортизола в пробе сыворотки крови пациента определяется из графика зависимости активности осажденного связанного J¹²⁵-кортизола от концентрации кортизола в калибровочных пробах.

Главные недостатки указанного аналога:
- наличие источника гамма-излучения в виде J¹²⁵-кортизола;
- соблюдение правил работы с радиоактивными веществами по третьему классу:
- наличие счетчика измерения типа "Гамма-1":
- трудоемкость хода определения:
- высокая стоимость оборудования.

Нами в качестве прототипа использован иммунометрический способ количественного определения кортизола в сыворотке крови человека (тест-набор Стероид ИХЛА КОРТИЗОЛ - ЗАО "Алкор-Био", С.Петербург, ул. Корпусная 28а. Тел. 7(812) 230-78-56.

В основе способа лежит конкурентный метод, основанный на усиленной люминесценции (конкуренция эндогенного кортизола, содержащегося в образце с кортизолом, меченным пероксидазой хрена, конкуренция за связывание с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок).

Способ осуществляют следующим образом:
1) приготавливают рабочий раствор (конъюгат кортизол-пероксидаза) путем смешивания концентрированного раствора "Конъюгата Е" и "Буфера А" в пропорции 1:25 в соответствии с таблицей:
- стрипов - 2-8;
- конъюгат Е - 320-400-520-600-680-800-920 мкл;
- буфер А-8-10-13-15-17-20-23 мл;
2) приготавливают восстановленные калибровочные пробы, для чего добавляют во флаконы с калибровочными пробами "1"-"6" и во флакон с контрольной сывороткой по 0,5 мл бидистиллированной воды;
3) приготавливают сигнальный раствор, для чего во флакон вместимостью 35 мл, адаптированный к диспенсеру Амерлайт, вносят сигнальные реагенты А и В в соотношении 1:1 и перемешивают;
4) готовят промывочный буфер, для чего в сосуд вместимостью 1000 мл вносят 450 мл бидистиллированной воды и добавляют 50 мл концентрированного "Буфера Р";
5) осуществляют следующую последовательность операции:
- устанавливают в держателе достаточное количество ячеек для анализа всех необходимых проб и образцов;
- пипеткой вносят в соответствующие лунки по 50 мкл калибровочных проб контрольной и исследуемых сывороток:
- диспенсором вносят в каждую лунку с антителами по 200 мкл конъюгата;
- накрывают лунки крышкой, встряхивают в течение 1 часа в инкубаторе-встряхивателе Амерлайт при 37^oС;
- промывают лунки в устройстве для промывки Амерлайт,
- вносят во все лунки с антителами по 250 мкл сигнального раствора LIANA;
- через 2-20 минут после внесения сигнального раствора считывают лунки на анализаторе Амерлайт, предварительно введя в анализатор значения содержания кортизолав калибровочных пробах:
- распечатывают анализы.

Недостатки способа:
1. Трудоемкость исполнения.

2. Дороговизна способа.

3. Применение отдельных устройств, дорогостоящего оборудования.

4. Наличие потенциально инфицированного материала (продукты крови человека).

Задачи:
1. Упростить способ приготовления пробы.

2. Выделить микротипы кристаллов по картине специфической кристаллизации кортизола за счет повышения уровня его концентрации в сыворотке крови.

3. Выявить типовые кристаллограммы сыворотки крови при гиперкортизолемии, обусловленной различными заболеваниями.

4. Сократить стоимость определения концентрации кортизола.

5. Снизить трудоемкость.

6. Повысить информативность.

Сущность изобретения заключается в том, что для определения гиперкортизолемии сыворотку крови больного наносят на предметное стекло, накрывают покровными стеклами, сушат при Т=+37-38^oС, выдерживают на открытом воздухе 2,5-3 часа, затем микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате скелетных папоротникообразных кристаллов определяют гиперкортизолемию.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Для забора используют периферическую кровь (из пальца), для чего скарификатором наносят повреждение в области пальца руки человека.

2. Капилляром Панченкова набирают кровь 0,06-0,1 мл.

3. Полученный объем центрифугируют для получения сыворотки.

4. Сыворотку в виде капель объемом 0,01-0,02 мл каждая наносят на предметное стекло и каждую каплю накрывают покровным стеклом.

5. Высушивают в термостате при Т=+37-38^oС на протяжении 1,5-2 часов.

6. Выдерживают на открытом воздухе 2,5-3 часа.

7. Под микроскопом в проходящем свете изучают картину кристаллизации и при наличии в препарате скелетных папоротникообразных кристаллов определяют гиперкортизолемию.

Нами предварительно были созданы модельные эталонные кристаллограммы, для чего сыворотку крови здорового человека, помещенную в стеклянную емкость, обогащали калибровочными пробами, содержавшими известное количество кортизола - 300, 400, 800 и 1000 ммоль/л.

На фиг.1 представлена кристаллограмма сыворотки крови (СК) здорового человека.

На фиг.2, 3 представлены эталонные кристаллограммы (КГ) сыворотки крови, обогащенной заведомо известной концентрацией кортизола.

На фиг. 2а, б видны мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы, концентрация кортизола составила 300 нмоль/л (а) и 400 нмоль/л (б).

На фиг. 3а, б видны крупные скелетные папоротникообразные кристаллы, концентрация кортизола составила 800 нмоль/л (а) и 1000 нмоль/л (б).

Нами проведено 1178 экспериментальных исследований.

Примеры:
Пример 1, фиг. 4. Б-ой П., история болезни (ИБ) 416. Диагноз: Болезнь Иценко-Кушинга На фиг.4 приведена КГ сыворотки крови больного П., присутствуют мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы.

Технология. Б-ому П. скарификатором нанесли повреждение в области пальца, капилляром Панченкова взяли 0,06 мл крови, ее отцентрифугировали. Капли сыворотки крови (СК), каждая объемом 0,01 мл, нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=+37^oС на протяжении 1,5 часов, затем выдержали на открытом воздухе 2,5 часа и микроскопировали в проходящем свете. Найдены мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы. Одновременно в СК определили концентрацию кортизола. которая оказалась повышенной и составила 410 нмоль/л (норма - 270,0±1,3 нмоль/л). Предполагаемая гиперкортизолемия подтвердилась.

Пример 2, фиг. 5. Б-ая В. ИБ 699. Диагноз: Аллергическая реакция. Крапивница. На фиг.5 приведена КГ сыворотки крови б-ой В., присутствуют мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы.

Технология. Б-ой В. скарификатором нанесли повреждение в области пальца. Капилляром Панченкова взяли 0,08 мл крови, ее отцентрифугировали. Капли СК, каждая объемом 0,02 мл, нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=+38^oС на протяжении 2 часов, затем выдержали на открытом воздухе 3 часа и микроскопировали в проходящем свете. Найдены мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы. Одновременно в СК определили концентрацию кортизола, которая оказалась повышенной и составила 320 нмоль/л (270,0±1,3 нмоль/л). Предполагаемая гиперкортизолемия подтвердилась.

Пример 3, фиг.6. Б-ная Г. ИБ 998. Диагноз: Сахарный диабет I типа с синдромом Мориака. На фото 6 приведена КГ сыворотки крови б-ой Г., присутствуют мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы.

Технология. Б-ой Г. скарификатором нанесли повреждение в области пальца. Капилляром Панченкова взяли 0,08 мл крови, ее отцентрифугировали. Капли СК, каждая объемом 0,01 мл, нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=+38^oС на протяжении 1,5 часов, затем выдержали на открытом воздухе 3 часа и микроскопировали в проходящем свете. Найдены мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы. Одновременно в СК определили концентрацию кортизола, которая оказалась повышенной и составила 350 нмоль/л (норма 270,0±1,3 нмоль/л). Предполагаемая гиперкортизолемия подтвердилась.

Пример 4, фиг.7. Б-ой М. ИБ 39. Диагноз: Астма, смешанная, тяжелая. Больная гормонозависима, постоянно принимает 15 мг преднизолона. На фиг.7 присутствуют крупные скелетные папоротникообразные кристаллы.

Технология. Б-ому М. скарификатором нанесли повреждение в области пальца. Капилляром Панченкова взяли 0,1 мл крови, отцентрифугировали. Капли СК, каждая объемом 0,01 мл, нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=+37^oС на протяжении 1,5 часов, затем выдержали на открытом воздухе 2,5 часа и микроскопировали в проходящем свете. Найдены крупные скелетные папоротникообразные кристаллы. Одновременно в СК определили концентрацию кортизола, которая оказалась повышенной и составила 850 нмоль/л. Предполагаемая гиперкортизолемия подтвердилась.

Пример 5, фиг.8. Б-ой Р. ИБ 218. Диагноз: Аденома надпочечника. На фиг. 8 присутствуют крупные скелетные папоротникообразные кристаллы.

Технология. Б-ому Р. скарификатором нанесли повреждение в области пальца. Капилляром Панченкова взяли 0,08 мл крови, отцентрифугировали. Капли СК, каждая объемом 0,01 мл, нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=+37^oС на протяжении 1,5 часов, затем выдержали на открытом воздухе 2,5 часа и изучили в проходящем свете. Обнаружены крупные скелетные папоротникообразные кристаллы. Одновременно в СК определили концентрацию кортизола, которая оказалась повышенной и составила 750 нмоль/л. Предполагаемая гиперкортизолемия подтвердилась.

Пример 6, фиг.9. Б-ая Л., ИБ 795. Диагноз: Системная красная волчанка, иммунокомплексный нефрит. На фиг.9 видны крупные скелетные папоротникообразные кристаллы.

Технология. Б-ой Л. скарификатором нанесли повреждение в области пальца. Капилляром Панченкова взяли 0,09 мл крови, отцентрифугировали. Капли СК, каждая объемом 0,02 мл, нанесли па предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=+38^oС на протяжении 1,5 часов, затем выдержали на открытом воздухе 2,5 часа и микроскопировали в проходящем свете. Найдены крупные скелетные папоротникообразные кристаллы. Одновременно в СК определили концентрацию кортизола, которая оказалась повышенной и составила 600 нмоль/л. Предполагаемая гиперкортизолемия подтвердилась.

Пример 7, фиг.10. Б-ой У., ИБ 795. Диагноз: Аденома гипофиза. Акромегалия. Синдром гиперкортицизма. На фиг.10 видны мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы.

Технология. Б-ой У. скарификатором нанесли повреждение в области пальца. Капилляром Панченкова взяли 0,1 мл крови, ее отцентрифугировали. Капли СК, каждая объемом 0,01 мл, нанесли на предметное стекло, каждую накрыли покровным стеклом и высушили в термостате при Т=+37^oС на протяжении 1,5 часов, затем выдержали на открытом воздухе 2,5 часа и микроскопировали в проходящем свете. Найдены мелкие скелетные папоротникообразные кристаллы. Одновременно в СК определили концентрацию кортизола, которая оказалась повышенной и составила 370 нмоль/л. Предполагаемая гиперкортизолемия подтвердилась.

Предлагаемый способ при использовании позволяет:
1. Упростить определение гиперкортизолемии.

2. Исключить необходимость в сложных реактивах и приборах.

3. Создать экономическую выгоду.

4. Обеспечить возможность экспресс-диагностики гиперкортизолемии, высокую информативность и достоверность.

Применение способа позволяет повысить достоверность получения результатов, значительно снизить трудозатраты, упростить способ определения гиперкортизолемии.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Способ позволяет упростить методику исследования и повысить информативность результатов исследования. Сыворотку крови больного наносят на предметное стекло, накрывают покровными стеклами, сушат при Т=37-38^oС, выдерживают на открытом воздухе 2,5-3 ч, затем микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате скелетных папоротникообразных кристаллов определяют гиперкортизолемию. 10 ил.

Способ определения гиперкортизолемии, отличающийся тем, что сыворотку крови больного наносят на предметное стекло, накрывают покровными стеклами, сушат при Т= (37 - 38)^oС, выдерживают на открытом воздухе 2,5-3 ч, затем микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате скелетных папоротникообразных кристаллов определяют гиперкортизолемию.