СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИПРОЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к профессиональной патологии и токсикологии, и может быть использовано как экспресс-метод для оценки фиброгенности различной пыли в эксперименте.

Известен способ определения фиброгенности пыли (Методические рекомендации МЗ СССР. "Обоснование предельно-допустимой концентрации (ПДК) аэрозолей в рабочей зоне", 1983, с.61-62) путем подсчета в бронхиальном лаваже количества нейтрофильных лейкоцитов и альвеолярных макрофагов и по их отношению НЛ/АМ определяют степень цитотоксичности и фиброгенности пыли.

Однако данный метод длителен и малочувствителен при действии тонкодисперсных аэрозолей, имеющих низкую величину удельной поверхности и высокую растворимость. Так при действии аморфной двуокиси кремния, отличающейся повышенной растворимостью и сниженной способностью к задержке в легких, выявляется несоответствие между высокой цитотоксичностью и низкой фиброгенностью пыли.

Известен способ определения свободного гидрооксипропилина в плазме крови путем внесения трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с последующим отделением надосадочной жидкости и добавлением к ней окислителя. Далее образующийся продукт окисления гидрооксипролина конденсируют с парадиметиламинобензальдегидом и измеряют его оптическую плотность. Плазму крови перед внесением ТХУ нагревают 2,0-2,5 мин до 98-100^о С, затем охлаждают до 18-22^оС. ТХУ вносят в концентрации 20% совместно с 55%-ной хлорной кислотой. Конденсацию ведут при нагревании смеси до 98-100^оС 75-80 с, а продукт конденсации перед измерением оптической плотности экстрагируют смесью четыреххлористого углерода и Н-бутанола, взятого в соотношении 1:3.

Однако с помощью известного решения при действии фиброгенной пыли в эксперименте невозможно выявить начальные процессы фиброза из-за низкой концентрации гидрооксипролина в крови и моче, кроме этого определение оксипролина в моче и крови дает оценку функционального состояния соединительной ткани организма в целом, при любых системных поражениях, в результате чего очень сложно отдифферинцировать за счет чего идет накопление их в крови и моче.

Цель изобретения - сокращение времени и упрощение проведения определения оксипролина. Поставленная цель достигается тем, что определение фиброгенности пыли осуществляется путем определения общего оксипролина в бронхиальном секрете. В экспериментальных условиях у животных под гексаналовым наркозом (50 мг на 100 г массы тела), в отпрепарированную трахею вводится металлическая канюля конической формы (можно применять толстую медицинскую иглу), которая фиксируется лигатурой на трахее. Шприцом вводится 5 мл стерильного физиологического раствора непосредственно в легкие и отсасывается обычным медицинским шприцом. При этом шприц переводится в вертикальное положение канюлей книзу и под давлением собственного веса бронхиальный секрет хорошо перемещается в шприц. У людей получают бронхиальный секрет при бронхоскопии.

Полученный бронхиальный секрет гомогенизировали с 3 мл экстрагирующего раствора, содержащего 0,45 NaCl в 0,05 М трис-буфере рН 7,4, в течение 10 мин, затем центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. Прибавляли 0,2 г смеси смолы Дауэкс, растертой с активированным углем 1:1, для уменьшения вероятности получения красного хромогена в реакции c другими аминокислотами. Перемешивали, оставляли на 20 мин, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин. Осторожно сливали надосадочную жидкость, добавляли 4 мл охлажденного этилового спирта тщательно перемешивали, отстаивали в течение 10 мин. Центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость сливали в пробирку N 1. Осадок промывали дважды спиртом (по 1 мл) и сливали в пробирку N 1. Полученную надосадочную жидкость нагревали 2-2,5 мин при 98-100^о С, охлаждали до комнатной температуры и добавляли 0,2 мл ТХУ и 0,4 мл 55%-ной хлорной кислоты. Содержимое тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин, 20 мин. Осторожно отбирали 1 мл прозрачного центрифугата в мерные пробирки и нейтрализовали 6 н NaOH по фенолфталеину и доводили объем до 2 мл. К 2 мл нейтрализованной смеси добавляли 2 мл H₂SO₄ и 0,5 мл 10%-ного раствора парадиметиламинобензальдегида в 96%-ном этаноле. Пробу тщательно перемешивали и нагревали 75-80 c при 98-100^о С, и охлаждали до комнатной температуры. Оптическую плотность полученных проб измеряют на ФЭКе при длине волны 558 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Существенными отличиями является то, что нами в предлагаемом способе получен бронхиальный секрет, разведенный физиологическим раствором 1:5, гомогенизированный в экстрагирующем растворе в стеклянном гомогенизаторе, содержащем 0,45 NaCl в 0,05 М трис-буфере, рН = 7,4, к которому добавляли 0,2 г смеси смолы Дауэкс, растертой с активированным углем в соотношении 1: 1, для уменьшения вероятности получения красного хромогена в реакции с другими аминокислотами. В результате избирательной экстракции коллагенов происходит более полный выход свободных и непрочно связанных между собой молекул коллагена, что имеет большое диагностическое значение для оценки начального фиброзного процесса непосредственно в очаге поражения бронхо-легочной ткани (в эксперименте и в клинических исследованиях).

В известном решении (Методические рекомендации "Обоснование ПДК аэрозолей в рабочей зоне". 1983, с.67-70) определения общего оксипролина (по методу Stegemann, 1958) имеются признаки, сходные с признаками, отличающими заявляемое решение от прототипа.

В известном решении у опытных и контрольных животных, затравленных фиброгенной пылью путем декапитации, выделяют легкие. Взвешивают сырое легкое, высушивают до постоянного веса, затем 10 мг высушенной ткани легких подвергают гидролизу в стеклянных запаянных ампулах с 1 мл 6н HCl. Гидролизат фильтруют в фарфоровые чашки для выпаривания. Фильтры промывают 6н HCl, затем упаривают на водяной бане и дважды промывают дистиллированной водой для удаления остатков соляной кислоты до нейтральной рН среды. В полученном гидролизате определяют общий оксипролин путем добавления 1 мл раствора хлорамина Т (или Б), перемешивают. После истечения 20 мин прибавляют 1 мл 3 М хлорной кислоты, перемешивают. Через 5 мин добавляют 1 мл 5% раствора n-диметиламинобензальдегида, нагревают до 60^о С 18 мин, охлаждают. Определяют оптическую плотность на СФ-4 в кюветах с ходом луча 10 мм, длина волны 558 нм.

Однако известное решение имеет ряд недостатков: длительная подготовка материала (легкие выделяют, высушивают и гидролизуют). Для получения гидролизата, в котором будут определять оксипролин, уходит 48 ч. Метод трудоемок (выпаривание анализирующего раствора).

Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию "существенные отличия".

Определение общего оксипролина в бронхиальном секрете основано на следующих теоретических предпосылках: основными особенностями аминокислотного состава коллагена, независимо от источника его получения, являются высокое содержание оксипролина, наличие глицина и серосодержащих аминокислот.

До сих пор остается широко распространенным метод идентификации и определения содержания коллагена в различных тканях по оксипролину. Стабильность коллагена во многом связана с количеством этого белка в молекуле. Lowther (1964), было показано, что ригидность и стабильность молекулы коллагенов в большей степени зависит от общего содержания оксипролина в белке.

Для выяснения регуляторной роли отдельных участков молекулы в образовании и ориентации коллагенового волокна в соединительной ткани (Diеtrich, 1970) подвергали избирательному расщеплению N-концевые участки полипептидных цепей коллагена лейциаминопептидазой, С-концевые - карбоксипептидазой. Если рассматривать коллагеновое волокно, как результат последовательно протекающей упорядочной агрегации молекул коллагена во внеклеточном пространстве, то можно ожидать, что соединительная ткань содержит наряду с коллагеном, входящим в состав волокон, также и коллагеновые волокна в свободном состоянии или в виде небольших агрегатов (В.И.Мазуров). В.Н. Орехович, А.В.Павлихина (1957) методом радиоактивных изотопов показали, что процесс формирования коллагеновых волокон проходит через стадию образования растворимого предшественника, который получил название проколлагена.

Существование в соединительной ткани отдельных фракций проколлагенов, которые отличаясь друг от друга по радиоактивности, представляют промежуточные формы в процессе образования волокон, фракцию проколлагена Iackson (1957) выделил при помощи нейтральных солевых растворов. В ранние сроки после введения С₁₄-глицина наиболее высокая радиоактивность была обнаружена во фракции, экстрагируемой 0,14 M NaCl, но затем на протяжении 27 ч максимум радиоактивности смещался постепенно к фракциям, которые были экстрагированы 0,45 NaCl. Эти результаты позволили сделать вывод, что в соединительной ткани имеется "спектр" из различно экстрагированных молекул коллагена, находящихся на различных стадиях фибриллогенеза: коллаген, растворимый в буферных растворах, представляет наиболее "старую" фракцию, а коллаген, экстрагированный нейтральными растворами низкой ионной силы, - "молодую", недавно синтезированную форму, о чем свидетельствует ее высокая удельная радиоактивность.

Авторами (Орехович В.Н., Мазуров В.И.) показано, что кислоторастворимый коллаген и коллаген, растворимый в нейтральных солевых растворах, не отличаются по содержанию глицина и оксипролина, а также по физикохимическим свойствам и аминокислотному составу. Избирательная экстракция коллагенов при действии различных растворителей является своеобразным отражением процесса фибриллогенеза коллагеновых белков в соединительной ткани: свободные или непрочно связанные между собой молекулы коллагена, обладающие наиболее высокой радиоактивностью, экстрагируются нейтральными солевыми растворами и представляют собой одну из первых стадий в процессе образования коллагенового волокна.

Кроме того, нейтральные солевые растворы солюбилизируют примерно такое же количество коллагена, которое в обычных условиях экстрагируется из ткани кислыми растворами (Iackson, Bentley, 1960). Таким образом, выделение фракций, растворимых коллагеновых белков, будет отражать процесс формирования фибриллярных структур при действии пыли.

Для оценки фиброзных процессов в легких мы использовали воздействие пыли. В качестве исходного образца был взят кварц - как стандарт при изучении фиброгенности пыли, представляющей собой высокодисперсный порошок со средним эквивалентным диаметром частиц 2 мкм. Удельная поверхность составляла 7,4 м²/г, содержание свободной двуокиси кремния равнялось 99,1%.

В опытах использовались беспородные крысы - самцы массой 150-180 г, которым интратрахеално вводилась пыль в дозе 50 мг в 1 мл физиологического раствора. Через 2 и 4 недели проводили исследования. Степень силикотического склероза оценивалась по весу легких, лимфоузлов и по содержанию оксипролина в легких.

В процессе выполнения метода нами было подобрано минимальное количество жидкости для хорошей воспроизводимости. Экспериментально подобрали соотношение смолы и активированного угля (1:1) для более полного осаждения белка, мешающего его определению. Установлен режим элюирования оксипролина при выделении его из белковых гидролиз.

Экспериментальные исследования показали, что на определение оксипролина в бронхиальном секрете уходит 2-3 ч. При определении общего оксипролина по способу-прототипу уходит время в пределах 48 ч.

Пример осуществления способа. У экспериментальных животных, предварительно затравленных кварцевой пылью или другой пылью, получали бронхиальный секрет, смешанный с физиологическим раствором в объеме 2-2,5 мл, помещали в гомогенизатор и добавляли 3 мл экстрагирующего раствора, содержащего 0,45 М трис-буфере рН= 7,4, оставляли в течение 10 мин. Затем в течение 10 мин гомогенизировали. Центрифугировали 30 мин при 3000 об/мин. Прибавляли 0,2 г смеси смолы Дауэкса, растертой с активированным углем в соотношении 1:1, перемешивали, оставляли на 20 мин. Затем центрифугировали при 3000 об/мин 20 мин, добавляли 4 мл охлажденного этилового спирта. Тщательно перемешивали. Центрифугировали 10-15 мин при 3000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость сливали в пробирку N 1. Осадок промывали дважды спиртом (по 1 мл) и сливали в пробирку N 1. Полученную надосадочную жидкость в пробирке N 1 нагревали 2-2,5 мин при 98-100^о С, охлаждали до комнатной температуры и добавляли 0,2 мл 20% ТХУ и 0,4 мл 55% хлорной кислоты. Содержимое тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Осторожно отбирали 1 мл прозрачного центрифугата в мерные пробирки и нейтрализовали 6 М NaOH по фенолфталеину и доводили объем до 2 мл дистиллированной водой. К 2 мл нейтрализованной смеси добавляли 2 мл H₂SO₄ и 0,5 мл 10%-ного раствора парадиметиламинобензальдегида в 96%-ном этаноле. Пробу тщательно перемешивали и нагревали 75 или 80 с при 98-100^о С, и охлаждали до комнатной температуры. Оптическую плотность полученных проб измеряли на ФЭКе при длине волны 558 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Определяют величину экстинкции каждой опытной пробы против слепой пробы, где вместо опытного образца помещают 1 мл дистиллированной воды. Одновременно ставят две пробирки со стандартным раствором. В каждую пробирку помещают 0,05 мл основного стандартного раствора оксипролина (10 мг%) и 0,095 мл дистиллированной воды. Содержание оксипролина в опытных пробах вычисляют по формуле
= = мкмоль/л, где Е_оп -экстинкция опытного раствора;
Е_ст - экстинкция стандартного раствора;
10 - концентрация стандартного раствора;
10 - перерасчет на 1 л;
0,05 - количество стандартного раствора (в мл);
1000 - перерасчет на микромоли;
131,14 - молекулярная масса оксипролина.

Точность предлагаемого способа была получена при 10-кратном повторении анализов одних и тех же образцов, возврат стандарта составил 95%, параллельно эти пробы исследовали по методу Stegemann (прототип). В табл.1 даем сравнительные данные по общему оксипролину, полученные у чистых крыс в бронхолегочном лаваже и в легких по способу-прототипу и заявляемому способу. При этом установлено, что заявляемый способ характеризуется более высокими метрологическими параметрами при более простом воспроизведении и меньшей затрате времени, чем способ-прототип.

В табл.1 приведены данные по определению общего оксипролина в бронхолегочном лаваже и тканях легких заявляемым способом и способом-прототипом. Заявляемый способ более прост в воспроизведении, меньше требует времени (2-3 ч) тогда, как на способ-прототип требуется времени в пределах 48 ч.

В табл.2 мы привели данные для сравнения полученных исследований бронхолегочного лаважа и легких по заявленному способу. Расхождение между двумя группами исследований составило в среднем 8%. Выявлена высокая корреляционная зависимость между ними, которая колеблется в пределах от 0,87 до 0,9. Следовательно, по определению общего оксипролина в бронхолегочном лаваже мы можем судить о фиброзных процессах в легких.

Таким образом, проведенное сопоставление показало достаточную эффективность исследования бронхолегочного лаважа на общий оксипролин с целью оценки развития фиброзных изменений в легких, что весьма важно в краткосрочных токсикологических исследованиях по нормированию промышленных пылей. Исключается трудоемкая работа по выделению оксипролина из ткани легких (сушка легких, гидролиз в течение 16 часов, выпаривание).

По данным табл.3 содержание оксипролина статистически достоверно возрастает по сравнению с контролем, по заявленному способу в бронхолегочном лаваже и по способу-прототипу, т.е. можно говорить о фиброзных процессах в легких. Для подтверждения гипотезы о фиброзных процессах в легких по изменению общего оксипролина в бронхолегочном лаваже и для проверки специфичности метода были проведены общепринятые в токсикологии исследования на развитие пневмокониоза (по весу легких, весу лимфоузлов, содержанию в легочной ткани липидов и оксипролина).

Как видно из табл.4 по всем количественным показателям установлено интенсивное развитие экспериментального пневмокониоза.

Таким образом, полученные результаты свидетельствует в пользу того, что заявляемый способ может быть использован в качестве краткосрочного метода выявления фиброгенности пыли.

Эффективность заявляемого способа состоит в том, что позволяет сократить время на проведение метода путем исключения трудоемких процессов (выделение, сушка, гидролиз легких).

Заявляемый способ требует в среднем 2-3 ч (по сравнению с известным) затрата времени уменьшена в 10-12 раз.

П р и м е р 1. Необходимо обосновать предельно допустимую концентрацию средства "Пемолюкс" в воздухе рабочей зоны. Для полной токсикологической характеристики необходимо выявить фиброгенность этого вещества.

С этой целью определяем содержание общего оксипролина в бронхолегочном секрете по предлагаемому способу. Параллельно провели количественный анализ на развитие пневмокониоза (вес легких, лимфоузлов, суммарных липидов), в том числе определяли содержание оксипролина в легких.

Согласно проведенным исследованиям выявлено достоверное увеличение общего оксипролина в бронхолегочном лаваже по сравнению с контролем, т.е. по предлагаемому способу данное вещество обладает фиброгенной активностью. Количественный анализ на развитие пневмокониоза также подтверждает, что средство "Пемолюкс" является фиброгенно активным веществом.

Таким о бразом, заявляемый способ позволяет за значительно меньшее время определить фиброгенность вещества.

П р и м е р 2. С целью более тщательного обоснования предельно допустимой концентрации чистящего средства "Чистоль" в воздухе рабочей зоны проведена токсилогическая характеристика препарата на фиброгенность.

После интрахиального введения чистящего средства "Чистоль" в легкие крысам, через месяц получен бронхолегочный секрет, в котором определяли общий оксипролин по предлагаемому способу. Параллельно провели количественный анализ на развитие фиброза (вес легких, лимфоузлов, суммарные липиды, общий оксипролин в легких).

Согласно табл.6 чистящее средство "Чистоль" не обладает фиброгенной активностью.

Таким образом, достоверность полученных данных предлагаемым способом подтверждается способом-прототипом, т.е. количественным анализом развития фиброза.

Использование: медицина, профессиональная патология и токсикология, для оценки фиброгенности различной пыли в эксперименте. Цель изобретения - сокращение времени и упрощение проведения определения оксипролина. Сущность: вводят 5 мл физиологического раствора непосредственно в легкие, получают бронхиальный лаваж, гомогенизируют его с экстрагирующим раствором, содержащим 0,2 г смеси смолы Дауэкс, растертой с активированным углем (1 : 1), центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин, добавляют 4 мл охлажденного этилового спирта. Нагревают 2 мин при 100°С, охлаждают и добавляют 0,2 мл ТХУ и 0,4 мл 55% -ной хлорной кислоты, центрифугируют при 3000 об/мин, отбирают 1 мл прозрачного центрифугата, титруют 6 н. NaOH по фенолфталеину и доводят объем до 2 мл, затем добавляют 2 мл H₂SO₄ и 0,5 мл 10% ПАБ в 96% этаноле. Пробу нагревают 80 с при 98 - 100°С , охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность. На анализ требуется 2 - 3 ч, что в 10 - 12 раз быстрее, чем по способу-прототипу. 6 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИПРОЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, включающий отбор биологического материала, прогревание его при 98 - 100^oС, охлаждение, обработку смесью трихлоруксусной (ТХУ) и хлорной кислот, отделение супернатанта, добавление к нему ПАБ, повторное нагревание смеси в течение 30 с при 98 - 100^oС с последующим измерением оптической плотности в полученной пробе, отличающийся тем, что биологический материал получают путем промывания бронхов и легких, вводя в них 5 мл физиологического раствора, выделяют бронхолегочный лаваж, гомогенизируют в присутствии экстрагирующего раствора 0,45 мл NaCl в 0,05 М трис-буфере pH 7,4, содержащего 0,2 г смеси смолы Дауэкса, растертой с активированным углем в соотношении 1 : 1, затем пробу центрифугируют, отделяют супернатант, осадок обрабатывают этиловым спиртом дважды, полученный экстракт объединяют с супернатантом, образец прогревают, охлаждают и обрабатывают ТХУ и хлорной кислотой, отделяют осадок, 1 мл супернатанта титруют 6 н. NaOH по фенолфталеину, доводят объем пробы до 2 мл и добавляют к ней 2 мл H₂SO₄ и 0,5 мл 10%-ного парадиметиламинобензальдегида в 96%-ном этаноле, пробу повторно нагревают 80 с при 98 - 100^oС, охлаждают до комнатной температуры и регистрируют оптическую плотность при 558 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.