СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ Российский патент 2000 года по МПК C12N9/26 A61K35/48 

Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья.

Большинство известных способов получения и очистки ферментных препаратов на основе тестикулярной гиалуронидазы предусматривают этап осаждения целевого продукта из экстракта семенников органическими растворителями (1,2,3) или сульфатом аммония (4,5). Однако, использование в производстве органических растворителей, из которых наиболее часто применяется ацетон, связано со значительными недостатками, главными из которых являются взрыво- и пожароопасность, потребность в громоздком оборудовании (отстойники, ректификационные колонны и т.д.) и огромных производственных площадях. Использование сульфата аммония, обладающего пирогенными свойствами, создает дополнительные трудности при получении медицинского препарата для парентерального введения.

В последнее время все большее распространение при выделении целевых продуктов из тканевых экстрактов и лизатов получают современные баромембранные и хроматографические методы.

Известен способ получения тестикулярной гиалуронидазы, включающий измельчение бычьих семенников с последующей экстракцией уксусной кислотой, отделение экстракта от мезги центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, концентрирование экстракта методом ультрафильтрации на мембранах с порогом пропускания 5 - 15 кД и двукратное замораживание-оттаивание концентрата с целью частичного удаления гемопигмента (6). Однако, этот способ, при всей своей простоте и доступности, не обеспечивает достаточно высокого выхода целевого продукта, а полученный препарат содержит значительное количество балластных белков и обладает низкой (менее 5 у.е./мг) удельной активностью.

Достаточно высокой степени очистки (17,9 у.е/мг) позволяет добиться способ получения гиалуронидазы, включающий измельчение семенников убойных животных, экстракцию из них гиалуронидазы раствором уксусной кислоты, взятым в масс/объемном соотношении 1:2,5, отделение экстракта центрифугированием, концентрирование ультрафильтрацией в тангенциальном потоке, удаление солей диафильтрацией, очистку от части балластных белков осаждением полиэтиленгликолем с последующим центрифугированием и доочистку фермента катионообменной хроматографией (7). Недостатки способа - низкий выход целевого продукта и сложности с масштабированием процесса, возникающие при центрифугировании больших объемов жидких субстратов.

Настоящим изобретением решена задача создания доступного и эффективного способа получения тестикулярной гиалуронидазы с более высоким выходом при сохранении требуемой активности и степени чистоты.

Цель достигается путем измельчения и гомогенизации семенников убойных животных, уксуснокислой экстракции гомогената в масс/объемном соотношении 1: 1,5, его замораживании при температуре -5...-20^oC с последующим оттаиванием, концентрированием ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранах с селективностью 15-20 кД, а также очистки целевого продукта путем последовательной исключающей сорбции балластных примесей этакридина лактатом и активированным углем.

Отличительными признаками предлагаемого способа от прототипа являются:
- уксуснокислая экстракция гомогената семенников в уменьшенном масс/объемном соотношении;
- использование метода криоструктурирования непосредственно после этапа экстракции;
- замена осаждения контаминирующих белков из экстракта полиэтиленгликолем с последующей доочисткой целевого продукта катионообменной хроматографией методом последовательной исключающей сорбции балластных примесей этакридином и активированным углем.

Преимущество предлагаемого способа по сравнению с прототипом заключается в существенном повышении выхода целевого продукта (см. таблицу) и исключении из процесса трудоемких операций центрифугирования.

Пример 1. 40 кг замороженных бычьих семенников измельчают электромясорубкой и добавляют в фарш 60 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты. Смесь гомогенизируют, пропуская трижды через роторно-пульсационный аппарат, и экстрагируют при 6^oC в течение 6 ч при периодическом перемешивании.

По окончании экстракции гомогенизат разливают по 10-12 л в бачки из нержавеющей стали или полиэтилена и подвергают замораживанию при температуре минус 5^oC с последующим оттаиванием. Для ускорения процесса размораживания бачки можно поместить в ванну с горячей водой.

После полного оттаивания, содержимое бачков фильтруют через капроновую сетку и осветляют на сепараторе типа АСГ-3М (6-8 тыс. об/мин). Осветленный экстракт концентрируют в 2-3 раза методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания 15 кД (например, ВПУ-15, ПО "Химволокно", г. Мытищи). В полученный концентрат добавляют этакридина лактат из расчета 0,4%. Раствор перемешивают и оставляют на ночь при (7±3)^oC для формирования осадка.

Сформировавшийся осадок удаляют фильтрованием через миткаль или фильтрокартон, после чего в фильтрат добавляют активированный уголь марки "А" из расчета 50 г/л, тщательно перемешивают в течение 1 ч и фильтруют на установке "ФС-3", заправленной пластинами марки "EKS". В результате получают 20 л очищенной тестикулярной гиалуронидазы с активностью 128 у.е. в мл и с содержанием белка 7,2 мг/мл (т.е. с удельной активностью 17,8 у.е./мг).

Полученный ферментный препарат смешивают с наполнителем - аминоуксусной кислотой (из расчета 20 г/л), подвергают стерилизующей фильтрации с последующим розливом в ампулы и лиофильной сушке.

Пример 2. 60 кг свежезамороженных семенников северного оленя измельчают и проводят все операции, как указано в примере 1, замораживая экстракт при температуре -20^oC и размораживая в емкостном вакуумном фильтре типа EBO-04K03 на решетке, покрытой миткалью при атмосферном давлении и температуре в верхней рубашке фильтра - (75±5)^oC, в нижней - (6±2)^oC. По мере оттаивания, экстракт фильтруется через миткаль и собирается в нижней емкости фильтра. Полученный экстракт концентрируют в 2-3 раза ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранах с селективностью 20 кД (например, ПА-20, "Владисарт", г. Владимир).

Полученный концентрат обрабатывают последовательно этакридина лактатом из расчета 0,2% и активированным углем марки "А" в количестве 30 г/л, как указано в примере 1. Получают 30 л очищенной гиалуронидазы с активностью 128 у.е. в мл, содержащей 7 мг/мл белка (удельная активность - 18,3 у.е./мг).

Препарат смешивают с наполнителем - полиглюкином (5 г/л), подвергают стерилизующей фильтрации, розливу и сушке.

Использованные источники информации:
1. Гуров В. А. Производство органопрепаратов /М. - "Пищевая промышленность". - 1976. - С. 81.

2. Лазарева И.В. и соавт. Способ получения лидазы /АС СССР N 827068. - A 61 K 37/48. - 1981.

3. Стекольников Л.И. и соавт. Способ получения гиалуронидазы /АС СССР N 955932. - A 61 K 37/48. - 1982.

4. Кирсе В.Х. и соавт. Способ получения гиалуронидазы /АС СССР N 632703, C 07 G 7/02. - 1978.

5. Патент Великобритании N 682933, C 12 N 9/24. - 1952.

6. Вахитов Р. З. и соавт. Способ получения гиалуронидазы /Патент РФ N 2068267. - A 61 K 35/48. - 1996.

7. Пак В.И., Офицеров В.И. Способ получения гиалуронидазы /Патент РФ N 2027759. - С 12 N 9/26. - 1995.8

Изобретение относится к производству лекарственных средств и заключается в получении препарата тестикулярной гиалуронидазы. Способ включает измельчение и гомогенизацию семенников убойных животных, уксуснокислую экстракцию гомогената в масс/объемном соотношении 1 : 1,5, его замораживание при температуре (-5) - (-20)^oC с последующим оттаиванием. Концентрирование проводят ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранах с селективностью 15-20 кД. Очистку целевого продукта ведут последовательной исключающей сорбцией балластных примесей этакридина лактатом и активированным углем. Способ обеспечивает повышение выхода и активности ферментного препарата. 1 табл.

Способ получения гиалуронидазы, включающий измельчение и гомогенизацию семенников убойных животных, экстракцию гомогената раствором уксусной кислоты, отделение целевого продукта, его концентрирование ультрафильтрацией и доочистку, отличающийся тем, что экстракцию раствором уксусной кислоты проводят в масс/объемном соотношении 1 : 1,5, полученный гомогенат подвергают криоструктурированию, замораживая его при температуре минус 5 - 20^oC с последующим оттаиванием, а доочистку проводят последовательной исключающей сорбцией балластных примесей этакридина лактатом в концентрации 0,2 - 0,4% и активированным углем, взятым из расчета 30 - 50 г/л.