Способ получения ронидазы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/26 

Изобретение относится к производи ству ферментных препаратов, применяв мьк в медицинской практике, а именно к способу получения ронидазы, приме« няемой при лечении рубцов, контрактур и тугоподвижности суставов,при подготовке к кожнопластическим опера«- циям по поводу Рубцовых стяжений, при длительно незаживающих ранах„

Цель изобретений « упрощение спо соба, повышение выхода и удельной активности препарата.

Способ заключается в том., что после экстракции измельченных семен« ников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,,7 и температуре 2 -40°С в тече ние 2«-4 ч проводят очистку экстракта

обработкой последнего белой глиной в количестве г на 1 л экстракт та в течение 1-2 ч с последующим отделением осадка белой глины и 6б«- работкой его водным раствором уксус - ной кислоты при. рН 4, ,7 при совом соотношении сорбента и раство ра , а экстракцию фермента проводят в атмосфере инертного газа

Схема технологического- процесса получения ронидазы представлена в следующем виде:

Семенники крупного рогатого скота

Измельчение

I Экстракция

о о о ел со

(0,1 и. CHjCOOH, жидкий коэффициент 1:1-2, рН 4,5,7, t 2-40°C, Ъ ч в атмосфере инертного газа)

5

Отделение экстракта

Очистка экстракта

i Сорбция фермента на белой глине ю

(25-50 г/л),Ј 1-2 ч, десорбция фермента раствором уксусной кислоты, р Н 4,5-4,7 (10-15 ч. на 1 ч.сорбента),

Ј о„5Н ч

415

Сушка раствора

Выход целевого продукта составляет 7,5-9% от исходной массы сырья, 4 гиалуронидазная активность 1020- 20 4050 усл.едс в 100 мг

Используемые параметры экстракций - величина рН раствора уксусной кис- оты 4,5-4,7, температура процесса

экстракции 2-40°С и время экстракции 25 2-4 ч, обеспечивают максимальное извлечение фермента При рН ниже 4,5 Или выше 4,7 в экстракт переходят балластные белковые вещества, содер- йсащиеся в семенниках, при температур 30 ре ниже 2°С скорость экстракции в Значительной степени замедляется и для ее осуществления требуется увеличивать время процесса экстракции более 4 ч, а при температуре выше35

40°С начинает происходить прогрессирующая инактивация фермента,.

Процесс экстракции проводят не в воздушной среде, а в атмосфере, ли- 4Q шенной кислорода, для чего через экстракционную смесь в течение всего периода экстракции пропускают инарт- ный газ (азот, аргон) со скоростью 0,2-0,4 л/ч на 1 л экстракта, по-45

скольку именно такая скорость пропускания инертного газа обеспечивает полное удаление кислорода 0 В отсутст- вие кислорода воздуха процессы окис- ления фермента не происходят и реак- ционноспособные группы в его молеку- ле, такие, например, как остатки метионина или цистина, не подвергают ся окислению Тем самым в экстрак- ционной смеси не накапливаются про- дукты окисления, не обладающие гиалу ронидазной активностью, отделение которых от нативной формы фермента является затруднительным и требует

50

55

5

Q 5

0

5

введения в технологический процесс специальных методов очистки„

В этой связи процесс очистки экстракта сводится к простым приемам сорбции и десорбции, занимающим не более ЗК5,5 ч на каждые 100 л экст ракта„ При этом в качестве сорбента используют белую глину, поскольку использование других известных с6р«- бентов, например активированного угля, не позволяет полностью сорбировать фермент и приводит к снижению выхода целевого продукта

На 1 л экстракта добавляют 25« 50 г белой глины, поскольку добавле ние меньшего количества этого сорбён - та (менее 25 г на 1л) не позволяет полностью сорбировать фермент не только за предусмотренный период такта с экстрактом ( ч), но и за более длительный промежуток времени (4-6 ч), а добавление большего колиг- чества сорбента (более 50 г/л) не приводит к увеличению выхода фермен - та и потому является технологически нецелесообразным При использовании г белой глины на 1 л экстракт та время полной сорбции фермента составляет ч и потому увеличение этого времени приводит к необосйог- ванному удлинению технологического процесса

Для быстрой (за 0,5Н ч) десорб«- ции фермента с поверхности сорбента используют водньй раствор уксусной кислоты, имеющий рН 4(,7, при этом количество раствора составляет ЮН 5 мае о ч „ на 1 мас0ч„ сорбента При величинах рН ниже 4,5 или выше 4f7, а также при снижении количестг- венного соотношения раствора и сбр бента (менее 10 ч раствора на 1 ч„ сорбента) достичь максимального извлечения фермента не удается даже при увеличении времени контакта раствора с сорбентом (более 2 ч) При увеличении количественного нотения раствора и сорбента (более 15 ч. на 1 ч. сорбента) повышения выхода фермента не наблюдается

Пример 1 „ 85 кг заморожен - ных семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 85 л (жидк., коэффициент 1:1) 0,1 HO водного раствора уксусной кислоты, устанавливают рН 4,5, через смесь пропускают газообразный азот со Скоростью 0,2 л/ч на 1 л

51666534

смеси и экстракцию проводят при и постоянном перемешивании в течение

2ч, жмых отделяют сепарированием

1

при 3000 об/мин и отбрасывают, а к

95 л экстракта добавляют 2,375 кг

белой глины из расчета 25 г на 1 л

(экстракта, смесь перемешивают при

20°С 1 ч, затем центрифугируют, к

осадку добавляют 23,75 л воды, пбдг

кисленной уксусной кислотой до рН

4,5 (из расчета 10 ч„ на 1 ч0 осадка),

смесь перемешивают 0,5 ч, затем

центрифугируют и надосадочную жйд«кость сушат распылением. Выход порош - 15 глины (из расчета 50 г/л экстракта),

10

Пример 3. 85 кг заморожен ных семенников крупного рогатого ско та измельчают дважды на волчке, до бавляют 170л (жидк„ коэффициент 1:2) 0,1 н водного раствора уксусной кислоты, устанавливают рН 4,7, через смесь пропускают газообразный азот со скоростью 0,4 л/ч на 1 л смеси и экстракцию проводят при 40°С и постоянном перемешивании 4 ч„ Жмых отделяют сепарированием при 3000 об/ /мин и отбрасывают, а к 142,5 л экстракта добавляют 7,125 кг белой

смесь перемешивают при 22°С в тече«- ние 2ч, затем центрифугируют, к осадку добавляют 106,8 л воды, кисленной уксусной кислотой до рН 20 4,7 (из расчета 15 ч на 1 ч осадка смесь перемешивают 1 ч, затем центри фугируют и надосадочную жидкость сушат распылениемо Выход порошка 7,65 кг (9% от исходной массы сырья) а его гиалуронидазная активность 2050 усл0ед„/100 мг, Формула изобретения

ка 6,375 кг (7,5% от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная актив - ность 1020 ед/100 мг

Для измерения активности исполь«- зуют метод, основанный на предупрежу дении образования муцинового сгустка

Пример 2085кг заморожеш- ных семенников крупного рогатого скота измельчают дважды на волчке, добавляют 127,5 л (жидк, коэффициент 1:1,5) 0,1 н. водного раствора - уксусной кислоты, устанавливают рК 4,6, через смесь пропускают газообг- раэный аргон со скоростью 0,3 л/ч на 1 л смеси и экстракцию проводят при 21°С и постоянном перемешивании в Те чение 3 ч Жмых отделяют сепарировав нием при 3000 об/мин и отбрасывают, а к 119 л экстракта добавляют 4,462 кг белой глины (из расчета 37,5 г/л экстракта), смесь переме шивают при 21°С в течение 1,5 ч, за« тем центрифугируют, к осадку добавг- ляют 55,77 л воды, подкисленной ук«- сусной кислотой до рН 4,6 (из расчег- jra t2,5 ч на 1 v, осадка), смесь {перемешивают 45 мин, затем центрифугируют и надосадочную жидкость сушат распылением Выход порошка 7,01 кг (8,25% от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная активность 1020 усЛовДо/ЮО мг„

Пример 3. 85 кг заморожен ных семенников крупного рогатого ско«- та измельчают дважды на волчке, до бавляют 170л (жидк„ коэффициент 1:2) 0,1 н водного раствора уксусной кислоты, устанавливают рН 4,7, через смесь пропускают газообразный азот со скоростью 0,4 л/ч на 1 л смеси и экстракцию проводят при 40°С и постоянном перемешивании 4 ч„ Жмых отделяют сепарированием при 3000 об/ /мин и отбрасывают, а к 142,5 л экстракта добавляют 7,125 кг белой

глины (из расчета 50 г/л экстракта),

смесь перемешивают при 22°С в тече«- ние 2ч, затем центрифугируют, к осадку добавляют 106,8 л воды, кисленной уксусной кислотой до рН 4,7 (из расчета 15 ч на 1 ч осадка), смесь перемешивают 1 ч, затем центрифугируют и надосадочную жидкость сушат распылениемо Выход порошка 7,65 кг (9% от исходной массы сырья), а его гиалуронидазная активность 2050 усл0ед„/100 мг, Формула изобретения

Способ получения ронидазы, вклкг

чающий экстракцию измельченных се« менников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,,7 и температуре 2«-40°С в течение ч с последующим отДе

лением экстракта и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения выхода и удельной актйвс- ности препарата, экстракцию осуществ«ляют в атмосфере инертного газа, а очистку проводят сорбцией экстракта белой глиной в количестве 25«-50 г на 1 л экстракта в течение 1 «-2 ч и десорбцией целевого продукта водным

раствором уксусной кислоты при рН ,7 при массовом соотношении сорбента и раствора 1:10Н5„

Изобретение относится к производству ферментного препарата ронидаза, применяемого в медицинской практике. Целью изобретения является упрощение способа, повышение выхода и удельной активности препарата. Способ осуществляют следующим образом. Семенники крупного рогатого скота измельчают, экстрагируют 0,1 н. раствором уксусной кислоты при PH 4,5 - 4,7 и 2 - 40°С в течение 2 - 4 ч в атмосфере инертного газа, экстракт отделяют и очищают сорбцией фермента в течение 1 - 2 ч на белой глине, которую берут из расчета 25 - 50 г на 1 л экстракта, и десорбцией водой при PH 4,5 - 4,7, которую берут из расчета 10 - 15 частей на 1 часть сорбента, а затем раствор сушат. Выход 7,5 - 9% от исходной массы, удельная активность 1020 - 2050 усл. ед. / 100 мг.