СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННОГО ПРОИЗВОДНОГО ГАЛАКТАНА Российский патент 1995 года по МПК C12P19/04 

Изобретение касается способа получения сульфатированного производного галактана, экстрагированного из клебсиеллы.

Французский патент ФП N 2 574 429 описывает ацилгликаны. экстрагированные из Клебсиеллы, состоящие приблизительно из 80% нейтральных сахаров, 20% липидов, меньше чем 2% протеинов, с мол.м. около 12500 и содержащих последовательности галактоз, связанных в положении - 3. Они обладают противоаллерги- ческими и иммуномодулирующими свойствами.

Заявка на французский патент N 89.09305 от 11 июля 1989 г. и заявка на европейский патент N 904019874 описывают галактан низкого молекулярного веса, экстрагированного из Клебсиелла, способ его получения, его применение в качестве лекарств, в частности лекарств иммуностимулирующих.

Данное изобретение касается способа получения нового сульфатированного производного галактана, экстрагированного из Клебсиеллы, исходя из полученного выше галактана.

Изобретение также имеет целью способ получения нового сульфатированного производного галактана, экстрагированного из Клебсиеллы, состоящего главным образом из нейтральных сульфатированных сахароз, в количестве 20-90% от гидрокислов.

Состав нейтральных сахаров определяется хроматографически в газовой фазе после метанолиза по способу ZANETTA J.Chromato (1972), 69, с.291 или способу KAMERLING/Biochem J. (1975), 151, с.491).

В частности, изобретение имеет целью способ получения сульфатированного производного галактана, образованного главным образом из сульфатированных нейтральных сахаров в количестве 40-80% от гидроксилов.

Среди продуктов, полученных по способу, являющемуся предметом изобретения, предпочтительно сульфатированное производное галактана, образованное главным образом из нейтральных сульфатированных сахаров в количестве 50-70% от гидроксилов.

Сульфатированное производное галактана, полученное по способу изобретения, образовано из линейной последовательности галактозы 1-3 и имеет молекулярный вес, находящийся между 5000 и 12000 и предпочтительно около 7000.

Эти полисахариды не содержат липидов и протеинов.

Состав галактозы определяется хроматографически в газовой фазе после восстановления и метанолиза.

Липиды определяются хроматографически в газовой фазе после метанолиза.

Протеины определяются способом LOWRY (J,B.C. (1951), 193, с.265-273.

Звено линейной последовательности галактоз определяется обычными способами метилирования, хроматографического анализа в газовой фазе, соединенного с масс-спектрометром, периодического окисления, ЯМР от ¹Н и ¹³С. Результаты показывают, что галактан образован из линейной цепи остатков галактозы, соединенных связями альфа (1-3) 50% и бета (1-3) 50% с повторяющимся элементом, образованным из 8 остатков галактопиранозы и 1 остатка галактофуранозы.

Сульфатированное производное галактана, полученного по способу изобретения, может быть приготовлено исходя из различных видов Клебсиелла. Особенно интересно сульфатированное производное Klebsiella pheumoiae, и в частности штамм, находящийся в Институте Пастера в Париже или Национальная Коллекция Культур Микроорганизмов (CNCM) под NN 52145 и 1-163 и National Culture Type Collection под N 5055.

Способ изобретения заключается в том, что экстрагированный из Клебсиелла ацилглинка, образованный главным образом из приблизительно 80% нейтральных сахаров, 20% липидов, меньше чем 2% протеинов и с молекулярным весом около 12500, обрабатывают мягким кислым гидролизом, хроматографируют с высоким выходом на анионобменнике, собирают не удержанную фракцию, подвергают фильтрации на геле, собирают фракцию, содержащую галактан мол.м. между 4000 и 10000, и сульфатируют таким образом полученную фракцию галактана, очищают диализом и выделяют таким образом полученное сульфатированное производное галактана.

Экстрагированный ацилгликан из исходной Клебсиеллы может быть получен исходя из бактерийного водорастворимого экстракта Клебсиеллы нагреванием, а затем хроматографическим фракционированием. Такое получение было уже описано во французском патенте ФR 2 574 429 и в немецком патенте ДЕ 3 543 267.

Бактерийный водорастворимый экстракт Клебсиеллы был получен по способу, описанному в патентах ФР - 2 490 496 и ЕП . 49182.

В предпочтительных условиях способа изобретения:
- мягкий кислый гидролиз ацилгликана ведется в 1%-ном растворе уксусной кислоты нагреванием при 100^оС в течение 90 мин; образовавшийся осадок, который содержит липидовую фракцию, удаляется центрифугированием, например 30 мин при 2000 G. Поверхностная часть, содержащая галактан, собирается и может быть лиофилизирована.

- тогда галактан отделяется от поверхностной части хроматографическим фракционированием. Собирают фракцию, образованную нейтральными сахарами.

- фракционирование может быть произведено хроматографически на анионообменнике, предпочтительно хроматогра- фией с высоким выходом, например на Магнум 9SAX Ватман. Хроматография с высоким выходом на анионобменнике состоит в том, что отделяют галактан элюцией водой. Требуемая фракция, образованная из нейтральных сахаров, обнаруживается детектированием спектрофотометрически при 200 нм и 492 нм после окрашивания пробой фенол - серная кислота, по способу ДЮБУА (Anal.Chem.(1956), 28, с. 350).

- данная фракция, образованная из нейтральных сахаров, подвергается фильтрации на геле, которая позволяет собрать фракцию, содержащую галактан с мол. м. , находящимся между 4000 и 10000. Фильтрация на геле ведется на известных носителях, находящихся в торговле, например на Сефадекс или Биогель агароз; предпочтительно употребляют Биогель А-1.5М.

- сульфатирование галактановой фракции ведется при помощи сульфоновой кислоты, такой как хлорсульфоновая кислота в среде амина, такого как пиридин или при помощи сульфоната, такого как N-сульфонат пиперидин, действуя нагреванием реакционной среды.

Диализ ведется с дистиллированной водой.

Сульфатированное производное галактана, полученное по способу, являющемся предметом данного изобретения, обладает очень интересными фармакологическими свойствами; в частности оно обладает замечательными иммуностимулирующими свойствами, а также хорошей толерантностью. В частности оно обладает свойством возбуждать образование Il₁ и TNF (Tumor Necrosis Factor) на уровне макрофаг и главное стимулировать образование свободных радикалов (полициклических). Оно позволяет также синергизировать эффект GM-CSF (Granulo- monocyte - Colohy Stimulating Factor).

Отмечают также замечательную анти-эластазную активность, как против панкреатической эластазы рогатого скота, так и против лейкоцитарной эластазы человека. Эти продукты обладают также противосвертывающейся активностью.

Эти свойства оправдывают употребление сульфатированного производного галактана, такой как он определен выше, в качестве лекарств.

Эти лекарства, например, находят применение при лечении или профилактике человека таких болезней, как иммунодепрессий, заразных болезней, вызываемых микробами или вирусами, и в частности вирусом СПИД (синдром полученный иммунодефиционный) при лечении паразитных болезней, токсикоинфекционных, при лечении послебольничных и послеоперационных заражений и аллергий всех происхождений. Эти лекарства могут также употребляться при лечении с пересадкой костного мозга и спинномозговых аплазий после лечения химическими средствами.

Обычная доза, изменяющаяся в зависимости от употребляемого продукта, лечимого больного и самой болезни, может быть например, от 0,5 до 5 мг в день через рот.

Эти лекарства находят также применение в пневмологии при лечении эмфиземы, воспалений легких, бронхитов, расстройств легких, причиненных табагизмом, или атмосферной поллюцией, в кардиологии при лечении артритов, а также, например, в дерматологии при лечении псориазиса, ожогов, булоз и при старении кожи, в гастроэнтерологии при лечении острых панкреатитов и в общем при лечении всех заболеваний, связанных с функционированием эластазы, а также как и при лечении тромбоэмболических болезней.

Обычная доза, изменяющаяся в зависимости от продукта, лечимого больного и самой болезни, может быть, например, 1-300 мг в день для человека внутривенным путем.

Сульфатированное производное галактана, экстрагированного из Клебсиеллы, такое как оно определено выше, может быть употреблено для приготовления фармацевтических составов, содержащих в качестве действующего начала это производное.

В качестве лекарств, сульфатированное производное галактана, экстрагированного из Клебсиеллы, такое как оно определено выше, может быть прибавлено к фармацевтическим составам, предназначенным для приема пищеварительным трактом, парентеральным приемом или местным способом.

Соответствующие фармацевтические составы могут быть, например, твердыми или жидкими, и выпускаться в обычно употребляемых для человека препаративных формах, как например, таблетки, драже, растворы, сиропы, свечки, лиофилизированные или нелиофилизированные препараты для инъекции, овулы, кремы, мази, жидкости для наружного применения, глазные капли, аэрозоли; они готовятся обычными способами. Одно или несколько действующих начал могут быть введены в эксципиенты, обычно употребляемые в этих фармацевтических составах, такие как тальк, гуммиарабик, лактоза, крахмал, стеарат магния, масло какао, неводные или водные носители, животные или растительные жиры, парафиновые производные, гликоли, различные смачиватели, дисперганты, эмульгаторы или консерванты.

П р и м е р 1. Сульфатированное производное галактана, экстрагированного из Клебсиелла. К пиридину, охлажденному до 0^оС во льду, прибавляют хлорсульфокислоты (0,4 см³). После возвращения к комнантной температуре прибавляют галактана, экстрагированного из Клебсиелла пнеумониае (25 мг) в суспензии в пиридине (24 см³). Смесь нагревают 3 ч при 80^оС, охлаждают до комнатной температуры, разбавляют дистиллированной водой (30 см³) и наконец обрабатывают 2,5 М раствором едкого натра (5 см³). Полученный раствор концентрируют в вакууме, диализируют дистиллиро- ванной водой 3 дня, замораживают и лиофилизируют.

Получают сульфатированное производное галактана, экстрагированного из Клебсиелла.

В полученном продукте гидроксиды сульфатированы в отношении 60% мол.м. около 7000.

Приготовление галактана, экстрагированного из Клебсиелла пнеумониае. Растворяют 334 мг ацилгликанов Клебсиелла (полученных как в примере 1 французской заявки N 2 574 429 исходя из штамма, находящегося в Институте Пастера под N 1-163) в 33,4 см³ 1- раствор уксусной кислоты и нагревают 90 мин при 100^оС. После охлаждения отделяют осадок, содержащий липидовую фракцию, центрифугированием при 2000 G 30 мин. Лиофилизируют поверхностную часть и выделяют 200 мг остатка, которые заново растворяют в 4 см³ воды. Хроматографируют фракциями в 1 см³ на колонке для хроматографии с высоким выходом анионобменника Ватман Магнум 9 SAX (9,4 мм˙50 см), элюируя водой 30 мин, под потоком в 2 см³/мин, обнаруживая при 200 нм. Выделяют фракцию, содержащую нейтральные сахара, обнаруженные при 492 нм, после пробы фенол-серный. Лиофилизированием выделяют 55 мг нейтральной фракции.

Выделение галактана. Предыдущий продукт лиофилизации растворяется в буферном растворе вода - уксусная кислота - пиридин (973 - 7 - 20), а затем подвергают фильтрации на геле хроматографией на колонке Биогель А.1.5М (2 см˙1.5 м) уравновешенной с тем же буферным раствором. Собирают обнаруженную фракцию пробой фенол-серная. Стерилизуют фильтрацией на мембране в 0,22 мкм, а затем лиофилизируют и получают 22 мг целевого галактана.

П р и м е р 2. Сульфатированное производное галактана, экстрагированного из Клебсиелла.

К пиридину, охлажденному во льду до 0^оС, прибавляют 4 см³ хлорсульфокислоты. После возврата к комнатной температуре прибавляют галактан, экстрагированный из Клебсиелла пнеумониае (полученного как это указано в приготовлении, описанном в примере 1) (85 мг) в суспензии в пиридине (24 см³). Смесь нагревают 2 ч при 80^оС, охлаждают до комнатной температуры и разбавляют дистиллированной водой (30 см³). Доводят рН реакционной смеси до 6 прибавкой 2,5М раствора едкого натра. Полученный раствор подвергают диализу дистиллированной водой, замораживают и лиофилизируют.

Таким образом получают 32 мг сульфатированного производного галактана, экстрагированного из Клебсиелла пнеумониае.

Биологическое исследование
Активность сульфатированного производного галактана, экстрагированного из Клебсиелла, определяется измерением торможения синкитий Грутерс и сот. Nature Tom 330 с. 74-77, 5, Ноябрь 1987) и определением защищающей активности, проявляемой против некоторых клеточных культур.

А) Приготовление и титрование вируса.

1) Приготовление вируса.

- плавающая часть клеток Н 9 111_в (хронически зараженных H1V), разведенных в течение 48 ч исходя из 10⁵ клеток/см³.

- центрифугированная плавающая часть, отфильтрованная при 0,45 мкмолей, содержащая без остатка и хранимая при -80^оС.

2) Титрование вируса.

- реверс транскриптаз (РТ)
На свежей плавающей части 4,0˙10⁶ имп/мин/см³
После оттаивания 4,5˙10⁶ имп/мин/см³
- опыт МТ4/МТТ
Техника:
100 мкл разбавления в серии вируса в пластинке микротитрования
- прибавление 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 5˙10⁴- клеток МТ4; -
-культура 7 дней при 37^оС, 5% СО₂;
- прибавка МТТ (соль тетразолиума краситель жизнеспособности)
- инкубация 4 ч при 37^оС;
- остановка реакции прибавкой раствора соляной кислоты в изопропане.

- отсчет оптической плотности (DO) при 540 нм (после раствора кристаллов).

Результаты. Определяют отношение оптической плотности зараженных клеток (цитотоксичность вируса = слабая DО) к оптической плотности зараженных клеток (жизнеспособность и DО максимальные) в зависимости от разбавления вируса (среднее число на 3 пути).

Чем больше клетки заражены и тем слабее это отношение.

Б) Защитная активность сульфатированного производного галактана экстрагированного из Клебсиеллы.

1) Торможение Синкитий.

Производят совместную культуру клеток Н 9 111 (хронически зараженных 10⁵ клеток (см³) с клетками SUP T1 (не зараженных: 2˙10⁵ клеток/см³).

Образуются синкитии, которые подсчитывают в микроскопе.

Каждый вид клеток преинкубирован или непреинкубирован с изучаемым продуктом одну ночь при 37^оС.

Если нет преинкубирования, то изучаемый продукт прибавляется на клетки, когда производят культуру.

Когда наблюдается торможение образования Синкитии в обработанных клетках по отношению к контрольным клеткам, то изучаемый продукт является защитником.

2) Опыт МТ/МТТ
Употребляются клетки МТ4 с 10⁶ клеток/см³. Разбавляют на 1/2 c или без изучаемого продукта с различными концент- рациями. Вводят на пластинку микротитрования 100 мкл вируса HIV различных разбавлений и 100 мкл преобработанной клеточной суспензии.

Инкубируют при 37^оС 7 дней, прибавляют МТТ и ведут отсчет на спектрофотометре.

Определяют процентное отношение торможения заражения клеток МТ4.

Полученные результаты даются в табл. 3.

3) Опыт Н 9.

Употребляют клетки Н9, которые обрабатывают полибреном, промывают, забирают в 100 мкл среды с или без изучаемого продукта различной концентрации.

Инкубируют 2 ч при 37^оС, прибавляют 100 мкл вируса HIV при 1/10, выдерживают 1 ч при 37^оС, промывают.

Клетки забирают в 1 см³ среды с или без изучаемого продукта, распределенные на 2 пути 500 мкл на путь и 2˙10⁵ клеток на путь.

В данный день + 4 прибавляют 500 мкл питающей среды с или без изучаемого продукта.

В данный день + 8 заменяют половину плавающей части новой средой.

В данный день +11 производят дозировку реверс транскриптаз на плавающей части и определение иммунофлуоресценции на клетках.

Результаты, полученные в различных опытах, показывают, что изучаемый продукт значительно тормозит образование синкитии и что он защищает изучаемые клетки от заражения, вызванное вирусом HIV.

Исследование противоэластазной активности.

Противоэластазная активность была определена спектрофотометрической дозировкой по отношению к лейкоцитарной эластазы человека (техникой, аналогичной той, которая описана Boudier и сотруд. Clin. Chim. Acta. 132- 309-315 (1985), см.ниже Продукт Человеческая пример лейкоцитарная
эластаза 1 Ki : 1˙10^-8 М

Использование: микробиология, фармакология. Сущность - проводят мягкий кислый гидролиз ацилгликана, состоящего из 80% нейтральных углеводов, 20% липидов и 25% протеинов, имеющего мол.м. 12500 и экстрагированного из бактерий Klebsiella pneumonial. Полученную смесь разделяют хроматографией на анионообменнике, лиофилизируют углеводную фракцию и подвергают ее гель-фильтрации. Фракцию, содержащую галактан с мол.м. 4000 - 10000, лиофилизируют и подвергают сульфатированию. Реакционную смесь диализируют и получают новое сульфатированное производное галактана со следующей характеристикой: образован линейной последовательностью остатков галактозы, соединенных связями (1 - 3), содержит 20 - 90% сульфатных групп, молекулярная масса 5000 - 12000. Продукт обладает иммуностимулирующими свойствами и проявляет антиэластазную активность. 5 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННОГО ПРОИЗВОДНОГО ГАЛАКТАНА, заключающийся в том, что ацилгликан, экстрагированный из бактерий Klebsiella pneumoniae с мол.м. около ≈ 12500 и образованный из приблизительно 80% нейтральных углеводов, 20% липидов и 2% протеинов, подвергают мягкому кислому гидролизу, хроматографируют на анионообменнике, лиофилизируют углеводную фракцию, подвергают ее гель-фильтрации, собирают фракцию, содержащую галактан с мол.м. 4000 - 10000, лиофилизируют, проводят сульфатирование полученной фракции галактана, затем реакционную смесь подвергают диализу и получают целевой продукт со следующей характеристикой: образован линейной последовательностью остатков галактозы, соединенных связями (1 - 3) (методы анализа: метилирование, периодатное окисление, спектрометрия); мол.м. 5000 - 12000; содержит 20 - 90% сульфатных групп. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфатирование фракции галактана проводят с помощью N-сульфоната пиридина, при этом реакционную смесь нагревают в течение 2 ч до 80^oС. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что диализ реакционной смеси ведут против дистиллированной воды. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что целевой продукт содержит 40 - 80% сульфатных групп. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что целевой продукт содержит 50 - 70% сульфатных групп. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного используют ацилгликан, экстрагированный из штаммов бактерий Klebsiella pneumoniae, находящихся в Институте Пастера в Париже (или в Национальной Коллекции Культур микроорганизмов) под NN 52145 и 1-163 и в Национальной Коллекции Типовых культур под N 5055.